VYUŽITÍ METODY RAPD K IDENTIFIKACI ODRŮD ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN

11.03.1997 | Odborné konference

Ing. Pavel Vejl

ČZU v Praze, Katedra genetiky a šlechtění

SOUHRN

Ze souboru odrůd pšenice, brambor a chmele byla izolována DNA. Variabilita mezi genotypy byla detekována metodou RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - náhodná amplifikace polymorfní DNA). Pro amplifikaci byla ověřována sada 30 primerů s délkami 13 bp, 10 bp a 8 bp. Pro identifikaci odrůd pšenice byl vybrán genotypově specifický primer 5GACGGATC3, bramor 5GATGACCG3 a chmele 5ACTTCGCCACGTA3. Pomocí těchto markerů byly vzájemně odlišeny všechny analyzované odrůdy pšenice, brambor a chmele. RAPD markery byly separovány na vertikální polyakrylamidové elektroforéze a vizualizovány pomocí Ag+ iontů. Elektroforeogramy byly po digitalizaci denzitometricky vyhodnoceny programem Gel Manger for Windows. Genetické podobnosti mezi jednotlivými genotypy byly vyjádřeny hodnotami Pearsonova korelačního koeficientu, které se rovněž staly podkladem pro vytvoření dendrogramu a sestavení databází pro identifikaci neznámých genotypů.

ÚVOD

Zavedení techniky RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - náhodná amplifikace polymorfní DNA) umožňuje objektivní stanovení odrůdové čistoty a pravosti. Současný světový trend množení a ozdravování sadbového materiálu chmele a brambor technikami in vitro představuje další aktuální oblast RAPD odrůdového markerování. Morfologické rozlišení odrůd chmele a brambor množených a ozdravovaných pomocí in vitro kultur je zcela nemožné.

Biochemicko-genetické markery

Charakteristika botanických taxonů na různých úrovních (rod - druh - kultivar) pomocí biochemicko-genetických markerů je aplikována v mnoha teoretických i aplikovaných vědních disciplínách. Genetické markery lze z aplikačního hlediska rozdělit následovně:

1. “Fingerprinting” - identifikace genotypů (pro stanovení pravosti a čistoty materiálu).

1. Evoluční genetika a taxonomie - studium vzájemných vztahů mezi taxonomickými skupinami (dendrogramy).

2. Markerování různých hospodářsky a agronomicky důležitých znaků a vlastností pro jejich introgresi.

3. Detekce specifických genů.

4. Tvorba genetických vazbových map.

Bílkovinné odrůdově specifické markery pšenice, brambor a chmele

Jako jedny z prvních biochemicko-genetických markerů byly použity zásobní proteiny pšenice (gliadiny a gluteniny) a ječmene (hordeiny). Souhrnný přehled těchto technik podávají například Černý a Šašek (1996). Problematikou zásobních proteinů - genetických markerů se u rodu Solanum zabývali Desborough a Peloquin (1968). Etalony elektroforeogramů separovaných proteinů hlíz sestavili Stegemann (1970) a Stegemann a Schnick (1985). In vitro meriklony chmele - Osvaldova klonu 72 charakterizoval pomocí elektroforézy proteinů rozpustných v alkoholu Vejl a Černý (1994). Zpracováním etalonového souboru spekter izoenzymů odrůd brambor se zabývali Desborough a Peloquin (1968) a Stegemann a Schnick (1985). Charakterizací meriklonů chmele se pomocí proteinů a izoenzymů zabývá Vejl a Černý (1994).

Markery založené na polymorfismu DNA

a) RFLP - délkový polymorfismus restrikčních fragmentů

Vyšší objektivitou, přesností a spolehlivostí se vyznačují techniky odrůdového “fingerprintingu” využívající polymorfismu DNA. Mezi historicky starší metody patří RFLP (Restriction Lenght Polymorphism - délkový polymorfismus restrikčních fragmentů). Obecné poznatky o RFLP shrnuje například Botstein et al. (1980). RFLP je využíváno kromě identifikace genotypů zejména pro vytváření tzv. RFLP map. Katalog RFLP markerů pšenice používaných při konstruování vazebných map publikoval Mc Intosh et al. (1992). Konstrukcí RFLP se u pšenice zabýval například Nelson et al. (1995a) a Nelson et al. (1995b). RFLP mapovací projekty Solanum tuberosum L.vytvořily vysoce nasycené RFLP mapy - průměrná hustota markerů je 1,2 cM (Gebhardt et al., 1989 a Tanksley et al., 1992).Délkového polymorfismu restrikčních fragmentů využili pro stanovení odrůdových rozdílů chmele otáčivého Pillay a Kenny (1994).

b) PCR - polymerázová řetězová reakace

Mezi další DNA markerovací techniky patří PCR (Polymerase Chain Reaction - polymerázová řetězová reakce) a RAPD. Obě techniky využívají polymorfismu in vitro amplifikované DNA, která je produktem enzymatické reakce Taq polymerázy nebo Tbr polymerázy. Obecný průběh polymerázové řetězové reakce popisují například Chein et al. (1976), Williams et al. (1990), Sambrook et al. (1989) a Innis a Gelfand (1990). Samec (1993) charakterizuje optimální složení a teplotní profily RAPD reakce následovně: denaturace templátové DNA při 90 - 95 oC, nasedání primerů při 35 - 40 oC a prodlužovací fáze při 72 oC.

SPLAT (Specific Polymorphic Locus Amplification Test) představuje původní typ PCR, kdy dochází k amplifikaci dvěma primery definovaného lokusu (Gale a Witcombe, 1992). Výhody metody spočívají v poměrně velké rychlosti analýz, v nepoužívání radioizotopů a v malém množství výchozí genomové DNA. Nevýhoda spočívá v obtížném získávání správných sekvencí primerů (Gale a Witcombe, 1992). V genetickém výzkumu pšenice a ostatních obilovin SPLAT použili například D´Ovidio a Anderson (1994), D´Ovidio et al. (1995), Chunwongse et al. (1993), Ko et al. (1994), Ko et al. (1996), Koebner (1995), Lee et al. (1994), Lee et al. (1995), Smith et al. (1994) a Van Campenhout et al. (1994). Matoušek a Trněná (1996) využili k identifikaci genotypů chmele polymorfismu genů pro 7SL RNA.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) představuje amplifikaci DNA s jedním náhodným primerem (přibližně 6-12 bází) náhodně hybridizujícím s templátovou DNA. Výhoda RAPD spočívá ve velké rychlosti analýz a detekci polymorfismů a v možnosti testování vysokého počtu primerů současně. Nevýhodou metody je detekce převážně dominantních markerů, detekce odlišných lokusů při odlišných kříženích a velká závislost na typu termocykleru a podmínkách amplifikace (Gale a Witcombe, 1992). RAPD markery v genetice pšenice a ječmene použili mimo jiné Demeke et al. (1996), Dweikat et al. (1993), Francis et al. (1995), Hartl et al. (1995), Horvath et al. (1995), Iqbal a Rayburn (1995), Penner et al. (1995), Poulsen et al. (1995), Procunier et al. (1995), Vejl (1995), Vejl a Salava (1995), Vierling a Nguyen (1992), Wang et al. (1995), Wight et al. (1994) a William et al. (1994). Využitím RAPD markerů při identifikaci různých klonů Solanum berthaultii, Solanum bulbocastanum, Solanum gourlayi a Solanum pinatisectum se zabýval Vejl (1995). Identifikací odrůd Solanum tuberosum se na základě polymorfismu RAPD produktů zabývá Demeke et al. (1993) a Le-Hingrat (1991). Genotypy chmele idnetifikovali pomocí RAPD markerů například Brady et al. (1996) a Pillay a Kenny (1996). Vejl (1997) rozlišil pomocí RAPD markerů 15 klonů chmele českého i zahraničního původu.

S rozvojem technik sekvencování (zejména lidského genomu) byly objeveny pravidelně se opakující sekvence DNA s různě dlouhým motivem repetice. Abundantní variability počtu tandemových repeticí v lokusu - VNTR (Variability of Number Tandem Repeat) je často využíváno pro markerování (Nakamura et al., 1987). VNTR pšenice studoval Talbert et al. (1992) a Vershinin et al. (1994). Pro studium taxonomie rodu Solanum a pro identifikaci kulturních odrůd využil Schweizer et al. (1993) amplifikace repetetivní DNA. Jakše et al. (1994) popisuje využití polymorfismu mikrosatelitní DNA pro rozlišení 12-ti slovinských odrůd chmele.

Pro vizualizaci polymorfismu RAPD odrůdových markerů je nutná elektroforetická separace amplifikované DNA. Barvení RAPD markerů při separaci horizontální elektroforézou s agarózovým gelem pomocí ethidium bromidu popisuje Williams et al.(1991). Využití vertikální elektroforézy s polyakrylamidovým gelovým nosičem a následné barvení Ag+ ionty popisují u různých botanických taxonů (Humulus sp., Solanum sp. a Triticum sp.)Caetano-Anollés a Gresshoff (1994), Vejl (1995), Vejl a Salava (1995) a Vejl (1997). Pro charakterizaci elektroforeogramů je možno použít hodnot REM (relativní elektroforetická mobilita). Tímto způsobem charakterizovali “fingerprinty” zásobních bílkovin pšenice Černý a Šašek (1996) a “fingerprinty” meriklonů chmele Vejl a Černý (1995). Denzitometrickou charakteristiku elektroforeogramů s využitím počítačové analýzy obrazu programem Gel Manager for Windows uvádějí u různých botanických taxonů Čurn et al. (1995), Vejl (1995), Vejl a Salava (1995) a Vejl (1997).

METODIKA

a) Rostlinný materiál

Pšenice obecná (Triticum aestivum L.)

K analýzám byl použit soubor těchto odrůd: Asta, Bruta, Hana, Jara, Linda,Maja, Mona, Samara, Sandra, Selekta, Simona, Sparta, Vega, Vlada a Trane. DNA byla izolována z etiolizovaných listů klíčících rostlin.

Lilek brambor (Solanum tuberosum L.)

Pro izolaci DNA byl použit modelový soubor 8 odrůd: Agria, Désirée, Eba, Liseta, Nicola, Panda, Quarta a Rustica. Z tohoto souboru genotypů byla DNA izolována z etiolizovaných klíčků a listů.

Chmel otáčivý (Humulus lupulus L.)

Pro experimenty byla použita kolekce 15 genotypů chmele otáčivého (Humulus lupulus L.) pěstovaných na chmelnici experimentálního pozemku ČZU v Praze: Poloraný žatecký červeňák - klon Blato, Poloraný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 31, Poloraný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 72, Poloraný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 114 Poloraný žatecký červeňák - klon Aromat Poloraný žatecký červeňák - klon Siřem Poloraný žatecký červeňák - klon Zlatan, Poloraný žatecký červeňák - klon Universal, Bor, Sládek, Northern Brewer, Vojvodina, Comet, Spalt a Tettnang.

b) Izolace DNA

Odebrané etiolizované klíčky resp. listové čepele resp. celé in vitro rostliny byly přeneseny do sterilních polypropylénových centrifugačních zkumavek a fixovány (usmrceny) přímým přelitím kapalným dusíkem. Fixovaný materiál byl použit přímo pro izolaci DNA. Pro izolaci byla zvolena modifikovaná metoda extrakce v přítomnosti cetyltrimetyl-bromidu amonného (CTAB) (Murray a Thompson, 1980 in TEMPUS,1993 a Sahai-Maroof, 1988 in TEMPUS, 1993). Izolovaná DNA byla UV-spektrofotometricky kvantifikována (Gene Quant, Pharmacia, Velká Británie) a naředěna na konstatní koncentraci (0,2 µ g. µ l-1). DNA byla uchovávána v roztoku 1 x TE při -40 oC.

c) Amplifikace DNA

Pro identifkaci genotypů bylo použito metody RAPD. Reakční směs (20 µ l) obsahovala: 0,6 U termostabilní polymerázy Thermalase Tbr (Amresco, USA), 0,24 µ g templátové DNA, 10 mM primeru (Amresco, USA) a 200 µ M dNTP (Amresco, USA). Reakční směs byla převrstvena 30 µ l PCR oleje. Případné proteinázy v templátové DNA byly tepelně deaktivizovány (94 oC, 2 minuty). Pro amplifikaci byla použita sada 30 primerů a velikosti 8 bp - 13 bp.

Pro amplifikaci DNA byl použit termocykler Cyclogene (Techne, Velká Británie) s následujícím teplotním a časovým profilem: 1 cyklus: denaturace (94 oC, 180 sekund), “annealing” (36,5 oC*, 39,5 oC**), prodlužování (72 oC, 120 sekund), 40 cyklů: denaturace (94 oC, 60 sekund), “annealing” (36,5 oC*, 39,5 oC**), prodlužování (72 oC, 120 sekund), 1 cyklus: prodlužování (72 oC, 600 sekund). Teploty “annealingu” označené * platí pro amplifikaci DNA Solanum tuberosum L. a Triticum aestivum L., označení ** platí pro amplifikaci DNA Humulus lupulus L..

Produkty amplifikace byly purifikovány fenol-chloroformem (1:1) protřepáním (10 minut). Po následné centrifugaci (5000 otáček . minuta-1, 5 minut, 5 oC) byla odpipetována vodná fáze, která byla použita pro elektroforetickou separaci. Produkty amplifikace byly uchovávány při -40 oC.

d) Elektroforéza RAPD markerů

Pro elektroforetickou separaci byla použita vertikální elektroforéza Mini Protean (BioRad, USA) s dělící dráhou 60 mm. Separace probíhala na 5 % polyakrylamidovém gelu s poměrem akrylamidu ku N,N-metylenbisakrylamidu 19:1 v 1xTBE pufru. Pro separaci bylo použito roztoku 5µ l RAPD produktu, 5 µ l nanášecího pufru (Sambrook et al., 1989) a 5 µ l deionizované H2O. Dělení probíhalo při následujících parametrech: konstanta 40 V, 15 minut a následně konstanta 60V, 100 minut. Molekulová hmotnost amplifikovaných fragmentů byla charakterizována pomocí současně separovaného standardu Lambda DNA/Eco471(AvaII) (MBI Fermentas, Litva).

Separované fragmenty byly fixovány na gelový nosič desetiminutovou inkubací v 10 % etanolu s 5 % CH3COOH. Následně byly gely prosyceny vodným roztokem 0,1 % K2Cr2O7 s 3,75.10-3 % HNO3 po dobu 5 minut. Po opláchnutí gelů deionizovanou H2O (2 x 5 minut) byly gely inkubovány 45 minut v 0,2 % roztoku AgNO3 v deionizované H2O. Po opláchnutí deionizovanou H2O byly gely vyvíjeny v 2,5 % vodném roztoku bezvodého Na2CO3 s 0,05 % formaldehydu. Vyvolávací reakce byla ukončena inkubací (5 minut) gelu v 5 % CH3COOH. Po opláchnutí deionizovanou H2O byly gely prosyceny 5 % roztokem glycerolu (60 minut) a následně vysušeny.

e) Vyhodnocení elektroforeogramů počítačovou analýzou obrazu

Elektroforeogramy byly digitalizovány stolním scannerem (Tamarac Art Scan 12000C, Holandsko) a po korekci zvětšení, kontrastu a pozadí programem iPhoto Plus version 1.1 byly uloženy ve formě *.TIF souborů. Pro vlastní počítačovou analýzu obrazu byl použit program Gel Manager for Windows (Biosystematika, Velká Británie). Bylo provedeno označení profilů jednotlivých RAPD markerů, korekce segmentů a pozadí. Pro následné statistické vyhodnocení denzitometrických profilů byly vybrány typické polymorfní “bandy”, které nebyly ovlivněny náhodnou amplifikací. Pomocí programu byl proveden výběr jednotlivých profilů a polymorfních “bandů”, korekce segmentů a pozadí. Genetické vzdálenosti resp. podobnosti mezi jednotlivými genotypy byly stanoveny na základě Pearsonova korelačního koeficientu, který porovnává pozici i denzitu “bandů” (Gel Manager for Windows, 1994).

r korelační koeficient

n počet profilů

i index prvního profilu

j index druhého

Y hodnota absorbance

Yav průměrná hodnota absorbance

VÝSLEDKY

a) Izolace DNA

Použitá metoda poskytovala u všech studovaných taxonů dostatečné množství DNA s kvalitou vhodnou pro její následnou amplifikaci metodou RAPD.

b) Amplifikace DNA

Většina testovaných primerů poskytovala RAPD produkty. Vysokou genotypovou specifitou a minimální frekvencí nespecifických amplifikací se u Triticum aestivum L. vyznačoval primer 5GACGGATC3., u Solanum tuberosum L. primer 5GATGACCG3 a u Humulus lupulus L. primer 5ACTTCGCCACGTA3.

c) Elektroforetická separace RAPD markerů

Metoda vertikální polyakrylamidové elektroforézy s barvením pomocí Ag+ iontů prokázala výbornou schopnost separace amplifikované DNA. Pomocí výše citovaného způsobu barvení gelů umožnila získání elektroforeogramů vhodných pro digitalizaci a následné vyhodnocení denzitometrickou analýzou. Elektroforeogramy RAPD markerů u pšenice, brambor a chmele jsou uvedeny na obrázcích 1,2 a 3. Molekulová hmotnost polymorfních “bandů” se u Triticum aestivum L. a Solanum tuberosum L. pohybovala v rozmezí přibližně 40 bp - 8000 bp a u Humulus lupulus L. přibližně 80 bp - 8000 bp - viz. obrázky 1, 2 a 3.

Obrázek 1: Elektroforeogram RAPD produktů - primer 5GACGGATC3 různých genotypů pšenice (Triticum aestivum L.)

Označení drah elektroforeogramu: 1 - Asta, 2 - Bruta, 3 - Hana, 4 - Jara, 5 - Linda, 6 - Maja, 7 - Mona, 8 - Samara, 9 - Sandra, 10 - Selekta, 11 - Simona, 12 - Sparta, 13 - Vega, 14 - Vlada , 15 - Trane, S - LambdaDNA/Eco471(AvaII) (hmotnostní standard)

Obrázek 2:Elektroforeogram RAPD produktů - primer 5GATGACCG3 různých genotypů brambor (Solanum tuberosum L.)

značení drah elektroforeogramu: 1 - Agria, 2 - Désirée, 3 - Eba, 4 - Liseta, 5 - Nicola, 6 - Panda, 7 - Quarta, 8 - Rustica, S - Lambda DNA/Eco471 (AvaII) (hmotnostní standard)

Obrázek 3:Elektroforeogram RAPD produktů - primer 5ACTTCGCCACGTA3 různých genotypů chmele otáčiváho (Humulus lupulus L.)

Označení drah elektroforeogramu: 1 - Poloranný žatecký červeňák - klon Blato, 2 - Poloranný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 31, 3 - Poloranný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 72, 4 -Poloranný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 114, 5 - Poloranný žatecký červeňák - klon Aromat, 6 - Poloranný žatecký červeňák - klon Siřem, 7 - Poloraný žatecký červeňák - klon Zlatan, 8 - Poloranný žatecký červeňák - klon Universal, 9 - Bor, 10 - Sládek, 11 - Northern Brewer, 12 - Vojvodina, 13 - Comet, 14 - Spalt, 15 - Tettnang, S - LambdaDNA/Eco471(AvaII) (hmotnostní standard)

d) Počítačová analýza obrazu - denzitometrické hodnocení

Elektroforeogramy RAPD odrůdových markerů pšenice s primerem 5GACGGATC3, brambor s primerem 5GATGACCG3 a chmele s primerem P2 5 ACTTCGCCACGTA 3 byly digitalizovány. Každý genotyp byl charakterizován pozicí a denzitou polymorfních “bandů”. Podobnosti mezi denzitometrickými profily jednotlivých genotypů byly charakterizovány hodnotami Pearsonova korelačního koeficientu. Korelační koeficienty dle Pearsona byly použity pro sestavení dendrogramů uvedených na obrázcích 4, 5 a 6.

Obrázek 4:Dendrogramové porovnání genetické vzdálenosti mezi genotypy pšenice (Triticum aestivum L.) s použitím RAPD markerů (primer 5GACGGATC3)

Označení genotypů: 1 - Asta, 2 - Bruta, 3 - Hana, 4 - Jara, 5 - Linda, 6 - Maja, 7 - Mona, 8 - Samara, 9 - Sandra, 10 - Selekta, 11 - Simona, 12 - Sparta, 13 - Vega, 14 - Vlada , 15 - Trane

Obrázek 5:Dendrogramové porovnání genetické vzdálenosti mezi genotypy brambor (Solanum tuberosum L.) s použitím RAPD markerů (primer 5GATGACCG3)

Označení genotypů: 1 - Agria, 2 - Désirée, 3 - Eba, 4 - Liseta, 5 - Nicola, 6 - Panda, 7 - Quarta, 8 - Rustica

Obrázek 6:Dendrogramové porovnání genetické vzdálenosti mezi genotypy chmele otáčivého (Humulus lupulus L.) s použitím RAPD markerů (primer 5ACTTCGCCACGTA3)

Označení genotypů: 1 - Poloranný žatecký červeňák - klon Blato, 2 - Poloranný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 31, 3 - Poloranný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 72, 4 -Poloranný žatecký červeňák - Osvaldův klon č. 114, 5 - Poloranný žatecký červeňák - klon Aromat, 6 - Poloranný žatecký červeňák - klon Siřem, 7 - Poloraný žatecký červeňák - klon Zlatan, 8 - Poloranný žatecký červeňák - klon Universal, 9 - Bor, 10 - Sládek, 11 - Northern Brewer, 12 - Vojvodina, 13 - Comet, 14 - Spalt, 15 - Tettnang

Využití programu Gel Manager for Windows pro identifikaci neznámého genotypu - odrůdy je demonstrováno na obrázku 7, kdy na základě porovnání denzitometrických profilů a korelačních koeficientů dle Pearsona byl neznámý genotyp identifikován jako odrůda Désirée (podobnost 100 %).

Obrázek 7:Identifikace neznámého genotypu Solanum tuberosum L. pomocí RAPD markeru (primer 5GATGACCG3) s využitím programu Gel Manger for Windows

Označení genotypů: 1 - Agria, 2 - Désirée, 3 - Eba, 4 - Liseta, 5 - Nicola, 6 - Panda, 7 - Quarta, 8 - Rustica, ??? - neznámá odrůda

DISKUSE

Použitá metoda pro izolaci DNA poskytovala dostatečné množství DNA v odpovídající kvalitě vhodné pro následnou amplifikaci. Obdobnou metodu izolace DNA (s CTAB) uvádějí u rodu Solanum například Vejl (1995) a u rodu Humulus Pillay a Kenny (1996) a Vejl (1997). Výtěžnost extrakce není citovanými autory uváděna.

Pro amplifikaci byla použita Tbr polymeráza (Amresco, USA). Všichni citovaní autoři amplifikovali DNA pšenice, brambor a chmele s použitím Taq polymerázy. RAPD reakce realizované s Tbr polymerázou (Amresco, USA) se vyznačovaly ve srovnání s Taq polymerázovou reakcí vyšší specifitou a vyšší molekulovou hmotností (bp) amplifikovaného produktu. Tyto poznatky se shodují s údaji uvedenými výrobcem enzymu. Odstranění proteináz z templátové DNA inkubací při 94 oC po dobu 2 minut neuvádí žádný z autorů. Použitá koncentrace MgCl2 v reakčním roztoku vychází z optimálního složení reakčního pufru, který je součástí použitého enzymu.

Teplotní a časový profil RAPD rekce je obdobný jako uvádějí u rodu Triticum Demeke et al. (1996), Dweikat et al. (1993), Francis et al. (1995), Hartl et al. (1995), Horvath et al. (1995), Iqbal a Rayburn (1995), Penner et al. (1995), Poulsen et al. (1995), Procunier et al. (1995), Vejl (1995), Vejl a Salava (1995), Vierling a Nguyen (1992), Wang et al. (1995), Wight et al. (1994) a William et al. (1994), u rodu Solanum například Demeke et al. (1993) a Le-Hingrat (1991) a u rodu Humulus lupulus Jakše et al. (1994) a Matoušek a Trněná (1996). Délka primerů 8 a 10 bp, kterou používali u chmele Pillay a Kenny (1996) poskytovala vyšší frekvence nespecifických amplifikací. Z testované sady primerů poskytoval u brambor i chmele pouze jeden RAPD produkty, podle kterých bylo možno vzájemně odlišit všechny analyzované genotypy. Tato skutečnost odpovídá závěrům, které získali Pillay a Kenny (1996), kteří pomocí 8 primerů z 60 testovaných odlišili 24 genotypů chmele otáčivého. Velikost genotypově specifických RAPD markerů byla u Triticum aestivum L. v rozmezí 40 bp - 8000 bp, u Solanum tuberosum L.v intervalu 60 bp - 5000 bp a u Humulus lupulus L v intervalu 150 bp - 5000 bp. Obdobnou velikost RAPD genotypových markerů uvádějí u pšenice například Demeke et al. (1996), Dweikat et al. (1993), Francis et al. (1995), Hartl et al. (1995), Horvath et al. (1995) a Iqbal a Rayburn (1995), u brambor rovněž Demeke et al. (1993) a Le-Hingrat (1991) a u chmele Jakše et al. (1994) a Pillay a Kenny (1996).

Separaci amplifikované DNA pomocí vertikální polyakrylamidové elektroforézy neuvádí žádných z citovaných autorů. Elektroforetická separace horizontální agarózovou elektroforézou, kterou uvádějí u pšenice Demeke et al. (1996), Dweikat et al. (1993), Francis et al. (1995), Hartl et al. (1995), Horvath et al. (1995) a Iqbal a Rayburn (1995), u brambor například Demeke et al. (1993) a Le-Hingrat (1991) a u chmele Jakše et al. (1994), Matoušek a Trněná (1996) a Pillay a Kenny (1996) byla nahražena vertikální polyakrylamidovou elektroforézou, která poskytovala po obarvení Ag+ ionty elektroforeogramy s kvalitou vhodnou pro digitalizaci a následné vyhodnocení programem Gel Manager for Windows.

RAPD genotypově specifické markery chmele jsou citovanými autory charakterizovány svou velikostí (bp) a počtem “bandů” (Jakše et al.,1994, Brady et al., 1996, Pillay a Kenny,1996). Denzitometrické vyhodnocení elektroforeogramů programem Gel Manager for Windows umožňuje objektivní stanovení podobností mezi elektroforetickými profily analyzovaných genotypů. Nároky na kvalitu vyhodnocovaných elektroforeogramů a všechny ostatní kroky počítačové analýzy obrazu se shodují s poznatky, které uvádějí například Čurn et al. (1995) ,Vejl (1995) a Vejl a Salava (1995) u “fingerprintingu” jiných botanických taxonů. Pro vyhodnocení podobnosti mezi elektroforetickými profily RAPD produktů (primer 5GATGACCG3 u pšenice, primer 5GATGACCG3 u brambor a primer 5ACTTCGCCACGTA 3 u chmele) bylo vzhledem k vysoké kvalitě elektroforeogramu (ostrost “bandů”, minimální pozadí) použito pouze Pearsonova korelačního koeficientu. Z těchto důvodů nebylo provedeno porovnání dle Diceho (pouze pozice RAPD markerů), které uvádějí například Čurn et al. (1995) ,Vejl (1995) a Vejl a Salava (1995), Vejl (1997).

U souboru analyzovaných odrůd pšenice je z dendrogramové studie patrné vyčlenění skupin (“clusterů”) odrůd jarního a ozimého typu. K obdobným závěrům dospěli rovněž Vejl (1995) a Vejl a Salava (1995).

Pomocí programu Gel Manager for Windows byla u souboru odrůd Solanum tuberosum L. provedena identifikace neznámého genotypu. Výsledek porovnání je uveden na obrázku 7. Aplikaci programu Gel Manager pro identifikaci neznámé odrůdy uvádějí rovněž Vejl (1995) a Vejl a Salava (1995).

Z dendrogramové studie je patrné vyčlenění skupiny klonů Poloraného žateckého červeňáku. Podobnost mezi RAPD profily markerů (primer 5ACTTCGCCACGTA 3) se v rámci této skupiny pohybuje mezi 65 % - 75 %. Klony Poloraného žateckého červeňáku byly na základě dendrogramového vyhodnocení rozděleny na dílčí skupiny (“clustery”): I. Blato a Osvaldův klon č. 114, II. Osvaldův klon č. 31, III. Aromat a Universal, IV. Zlatan, V. Osvaldův klon č. 72 a Siřem.

Od skupiny Poloraného žateckého červeňáku se výrazně odlišují ostatní analyzované genotypy. Samostatné “clustery” vytvářejí: VI. hybridní odrůdy Bor a Sládek a odrůda Vojvodina, VII. Comet, VIII. Spalt a Tettnang a IX. Northern Brewer.

Rozčlenění souboru 15 genotypů chmele otáčivého do 9 “clusterů” výrazně koresponduje se zemí původu dané odrůdy (samostatné “clustery” genotypů pocházejících z ČR, SRN, USA a Velké Británie). Tato skutečnost zřejmě svědčí o odvození odrůd z obdobných genových zdrojů typických pro danou oblast. Zajímavé je zjištění poměrně velkých rozdílů (vytvoření pěti “clusterů”) v rámci Poloraného žateckého červeňáku.

Schopnost RAPD metody vzájemně odlišit tyto geneticky vysoce příbuzné genotypy (jednotlivé klony Poloraného žateckého červeňáku) poukazuje na její velkou citlivost a vhodnost pro identifikaci odrůdové pravosti. Vzhledem k tomu, že RAPD představuje náhodnou amplifikaci polymorfní DNA je nemožné na základě těchto výsledků hovořit o markerování znaků jakosti brambor a chmele pomocí RAPD markerů. Studium RAPD genotypově specifických markerů představuje výchozí krok, který ve spojení s hybridologickými analýzami a ostatními metodami genetického markerování umožní mapování a markerování hospodářsky významných vlastností.

ZÁVĚR

Publikované výsledky poukazují na další možnosti identifikace genotypů - odrůd pšenice, brambor a chmele pomocí přímé analýzy DNA metodou RAPD. Použitá metoda umožňuje stanovit odrůdovou pravost a čistotu z minimálního množství rostlinného materiálu. Pomocí RAPD metody lze spolehlivě detekovat odrůdový polymorfismus (“fingerprinting”) analýzou různého biologického materiálu (listy, kořeny, in vitro rostliny, klíčky) bez ohledu na vývojovou fázi rostliny (klíčící i zcela vzrostlé rostliny). Výsledky experimentů je možno shrnout do následujících bodů:

1. byla optimalizována metoda pro izolaci DNA z různých částí rostlin

1. byl navržen teplotní a časový profil RAPD reakce

2. byly vybrány primery, které poskytují genotypově specifické RAPD markery pro všechny analyzované botanické druhy

3. byla vypracována metoda elektroforetické separace a vizualizace RAPD markerů

4. RAPD markery byly vyhodnoceny počítačovou analýzou obrazu - program Gel Manager for Windows.