POLYFENOLICKÉ SLOUČENINY - ANTIOXIDANTY OVLIVŇUJÍCÍ BIOLOGICKOU KVALITU OSIVA

Polyphenolic compounds - antioxidants influencing biological quality of seed

Doc. Ing. Jaromír Lachman, CSc.

Ing. Vladimír Pivec, CSc.

Ing. Matyáš Orsák

Doc. Ing. Václav Hosnedl, CSc.

Ing. Evženie Prokinová, CSc.

ČZU v Praze

RNDr. Oldřich Lapčík, PhD.

Endokrinologický ústav

Abstract

Polyphenols play are important role in the defense system and in the delicate mechanism of oxygen control and its access to seed embryo. In three barley cultivars from five different localities were investigated changes in total polyphenol content (TP) and catechol, resorcinol and phloroglucinol type polyphenols (CRP) and three pea cultivars TP and isoflavonoid contents caused by accelerated ageing test with increased temperature and moisture. The total TP were determined by means of Folin-Ciocalteau´s reagent and CRP with p-dimethylamino-cinnamaldehyde and isoflavonoids with RIA method. The process of seed deterioration and also influence of Epicoccum purpurascens Ehrenb. ex Schlecht. elicitors caused the increase of both TP and CRP in barley grains and TP in pea seeds, too. There were significant differences in total polyphenols contents and catechol, resorcinol and phloroglucinol contents among barley and pea cultivars and localities (1995-1997) where the plants were cultivated.

Barley grains; pea seeds; polyphenols; Folin-Ciocalteau´s reagent determination; p-dimethylaminocinnamaldehyde determination; accelerated ageing treatment; deteoriorated changes in polyphenols; influence of E. purpurascens elicitors; varietal and environmental differences

Polyfenolické látky jsou přírodní látky, které jako sekundární metabolity jsou zastoupeny v každé vyšší rostlině a v každém jejím orgánu. Tyto látky představují mnoho typů sloučenin, např. flavonoidy, které lze dále rozdělit naflavony, flavonoly, isoflavony, chalkony, aurony, redukované flavanoly resp. flavan-3,4-dioly, dále pak fenolkarboxylové kyseliny a s nimi úzce spojené kumariny, anthokyanová barviva a jejich redukované formy leukoanthokyanidiny. Struktura a typ těchto látek jsou pro jednotlivé druhy rostlin charakteristické .

Polyfenolické látky si vytvářejí rostliny na svoji obranu proti škůdcům a chorobám, neboť mnohé z nich mají značnou fungicidní, baktericidní i virocidní účinnost, chrání embryo klíčku před škodlivými vlnovými délkami ultrafialového záření. Zatímco zde je jejich role pozitivní, ve výživě se některé typy uplatňují negativně. Důvodem je to, že zvláště rozpustné frakce vysokomolekulárních polyfenolů o m.h. 500-3.000 se váží s bílkovinami do nerozpustných komplexů, které nejsou monogastrickými organismy využitelné. Způsobují snížený příjem a využití potravy, hmotnotnostní úbytky a sníženou retenci sušiny a aminokyselin. Existuje vysoce negativní vztah mezi obsahem polyfenolických látek v zrnu a stupněm využití aminokyselin a energie diety. Z nich mají význam především vysokomolekulární polyfenoly, tzv. ”taniny”a jejich prekursory, tj. látky obsahující floroglucinolová, katecholová a resorcinolová jádra, z nichž mohou vysokomolekulární látky vznikat polykondenzačními reakcemi a snižovat tak stravitelnost a využitelnost bílkovin. Na využitelnost bílkovin má především vliv jejich rozpustnost, která je v nepřímé závislosti s obsahem vysokomolekulárních taninů. Taniny způsobují také podstatně horší hydrolýzu proteinasami, zvláště trypsinem.

Existuje značná korelace mezi kultivarem a obsahem frakcí polyfenolických látek, kdy kultivary luskovin kvetoucí bíle a mající osemení bílé, resp. světlé barvy obsahují podstatně méně polyfenolických sloučenin a jejich stravitelnost sušiny in vitro celých semen je značně vyšší než u odrůd kvetoucích barevně a majících slupky semen tmavě zbarvené. Tato diferenciace mezi kultivary spočívá především v obsahu polymerních frakcí kondenzovaných polyfenolických látek, jejichž extrakty tvoří tmavě zbarvený polymerní komplex a snižují využitelnost živin a především pak bílkovin.

Flavonoidy (převážně anthokyany, flavonoly, flavony, katechiny a flavanony), isoflavonoidy a ostatní polyfenoly (fenolkarboxylové kyseliny, lignany, stilbeny resp. dusík obsahující betalainy aj.) jsou silnými antioxidanty, které zachycují volné radikály (”scavenging effect”).

Pokud se jedná o konzumaci semen, jsou obsaženy hlavně v obalových vrstvách - slupkách, osemení apod. Některé polyfenolické sloučeniny vysoce methoxylované mají antikancerogenní účinky.

Identifikace kultivarů různých druhů luskovin s nízkým obsahem polyfenolických látek a zvláště pak kondenzovaných taninů, jejichž extrakty podléhají jen minimálně tmavnutí, může zajistit šlechtitelům genetickou základnu pro inkorporaci těchto znaků do šlechtění nových nutričně příznivých kultivarů.

Vzhledem k tomu, že obsah i kvalita polyfenolických sloučenin je ovlivňována řadou vnějších faktorů, především stresových, zaměřili jsme se v tomto příspěvku na sledování ovlivnění obsahu polyfenolických v semenech hrachu a ječmene způsobené testem urychleného stárnutí, tj. působením zvýšené teploty a vlhkosti a změny v obsahu polyfenolů v obilkách ječmene vyvolané elicitory houby Epicoccum purpurascens Ehrenb. ex Schlecht.

Materiál a metody

V létech 1995, 1996 a 1997 byl sledován obsah celkových polyfenolických látek (CP) a látek typu resorcinolu, floroglucinolu a katecholu (RFK) v semenech ječmene ( u 3 odrůd - Akcent, Amulet a Forum ze 4 lokalit - Branišovice, jaroměřice, Krásné Údolí a Staňkov). V semenech hrachu ( u 3 odrůd - Komet, Lantra a Menhir z 5 lokalit - Čáslav, Jaroměřice, Staňkov, Šumperk a Žatec) byl sledován obsah celkových polyfenolů (CP) a látek isoflavonoidního typu (daidzein, isoformononetin, genistein a prunetin). Byl sledován vliv deteoračních změn semene vlivem působení vyšší teploty a vlhkosti na změnu obsahu těchto látek.

Vzorky naklíčeného hrachu a ječmene po kultivaci (14 dní při 24oC) na vodném filtrátu, hrachovém, ječmenném a bramborovém extraktu s glukosou a asparaginové živné půdě po inkubaci s houbou Epicoccum purpurascens bez a s následující sterilizací oproti kontrolním vzorkům bez inkubace s E. purpurascens byly testovány v r.1997.

Rozemleté vzorky hrachu a ječmene byly extrahovány v Soxhletových přístrojích po dobu 22 hodin bez přerušení v 80% vodném ethanolu a extrakty byly kvantitativně převedeny do 250 ml odměrných baněk a doplněny 80% vodným ethanolem po rysku. Analogicky homogenát bramborových hlíz byl převeden do 100 ml odměrné baňky (10 g), doplněn 80% vodným ethanolem a po filtraci bylo ke stanovení pipetováno 5 ml filtrátu.

Stanovení obsahu celkových polyfenolických látek bylo provedeno Folin -Ciocalteuovým činidlem. Z výše získaných extraktů byly k vlastnímu stanovení pipetovány alikvotní podíly 5 a 10 ml do 50 ml odměrných baněk. Po zředění destilovanou vodou na objem cca 30 ml bylo přidáno 2,5 ml Folin-Ciocalteuova činidla p.a. (Zdravotnické zásobování Praha), směs promíchána a po 3 min. bylo přidáno 7,5 ml 20% roztoku Na2CO3 a objem doplněn po rysku destilovanou vodou. Po řádném promíchání byla tvorba barevného komplexu ukončena po 2 hodinách stání. Případná opalescence roztoku před vlastním měřením absorbance byla odstraněna odstředěním roztoků na centrifuze Janetzki T 30 při 10.000 ot.min-1 po 5 resp.12 min. Poté byla změřena absorbance modře zbarveného roztoku v kyvetách o síle vrstvy 0,5 cm při vlnové délce l =765 nm na Spekolu 11 proti slepému pokusu. Polyfenolické látky byly vyjádřeny jako galová kyselina (mg ve 100g hmoty, resp. sušiny).

Stanovení m-dihydroxylových fenolických skupin v polyfenolech typu katecholu, resorcinolu a floroglucinolu v semenech hrachu a obilkách ječmene bylo provedeno s p-dimethylaminoskořicovým aldehydem (p-DMSA). 25 ml alikvotní podíly byly odpařeny na vodní lázni do sucha a poté rozpuštěny v 15 ml methanolu a kvantitativně převedeny do 25 ml odměrných baněk. Do každé baňky bylo přidáno 6 ml 3M HCl v methanolu a po promíchání byly doplněny po rysku. Poté bylo přidáno 1 ml p-DMSA činidla (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn bei München) a po důkladném promíchání byl roztok ponechán stát po 30 min. Poté byla změřena absorbance na Spekolu 11 oproti slepému pokusu při l =638 nm a polyfenoly vyjádřeny jako floroglucinol [C6C3(OH)3.2H2O, The British Drug House, Ltd.].

Isoflavonoidní látky v semenech a naklíčených semenech hrachu byly stanoveny metodou RIA a identifikovány HPLC (LAPČÍK et al., 1997).

Test urychleného stárnutí byl proveden dle TE KRONYHO (1995), kdy zvážená semena byla umístěna do vnitřního boxu termostatu obsahujícího 50 ml vody a na semena působila teplota 410 C po 72 hod.

Výsledky a diskuse

Polyfenolické látky obsažené v semenech, především v jejich obalových vrstvách, jsou důležitou skupinou sekundárních metabolitů, které hrají významnou roli v obranném systému a jemném mechanismu přístupu kyslíku k embryu, neboť jejich oxidace polyfenoloxidasami redukuje zásobování embrya kyslíkem (ESCUREDO et al., 1996). Inhibiční účinek se zvyšuje s teplotou, neboť kyslík se stává méně rozpustným a oxidace fenolických sloučenin je intenzivnější. Látky polyfenolického charakteru jsou významnými antioxidanty působícími v síti antioxidantů a zachycující volné radikály. Z tohoto hlediska ovlivňují významně kvalitu obilovin a luskovin. Látky typu RFK byly u ječmene vybrány proto, že vysoká antioxidační účinnost obilek ječmene je způsobena především flavan-3-oly a flavan-3,4-dioly (MAILLARD et al., 1996), které jsou v polyfenolickém komplexu obilek ječmene zastoupeny až 85 %. Pro luskoviny jsou typické látky isoflavonoidního charakteru, které mají antikacerogenní a slabé estrogenní účinky, snižují hladinu LDL a nepříznivého cholesterolu a riziko atherosklerosy čímž se uplatňují příznivě ve výživě (HENDRICH et al., 1994).

Ročník 1995 byl ověřovací pro použití jednotlivých metodik, podstatné výsledky byly získány v létech 1996 a 1997. Obilky ječmene a semena hrachu se značně liší v obsahu polyfenolických látek (Tab. I a II) - 121,36 (1996) a 140,57 (1997) mg ve 100 g obilek ječmene a 73,89 (1996) a 51,78 mg ve 100 g semen hrachu. Zvláště velké rozdíly byly zjištěny v obsahu polyfenolů typu katecholu, resorcinolu a floroglucinolu, kdy obilky ječmene obsahovaly průměrně 24,11 resp. 4,17 mg, zatímco semena hrachu obsahovala pouze nepatrné množství (0,72 mg ve 100 g semen).

Deteriorační ošetření zvýšenou vlhkostí a teplotou způsobilo nárůst obsahu celkových polyfenolů a u ječmene také m-dihydroxylových fenolických skupin. Jak v semenech hrachu tak i v obilkách ječmene byly nalezeny meziodrůdové a mezilokalitní rozdíly v obsahu celkových polyfenolů i polyfenolů typu katecholu, resorcinolu a floroglucinolu. Rovněž u hrachu dochází vlivem testu urychleného stárnutí k nárůstu obsahu CP (ze 73,89 na 89,98 mg r.1996 a 51,78 na 71,39 mg/100 g) a v obou ročnících k signifikantnímu nárůstu daidzeinu (z 0,205 na 0,421 m g/1 g v r. 1996 a z 0,459 na 0,656 m g/1 g v r.1997). Z hlediska rozdílů zastoupení těchto látek se jevil jako výraznější rok 1997, kdy byly zjištěny i signifikantní rozdíly u obsahu isoformononetinu, genisteinu a prunetinu.

U ječmene byly zjištěny průkazné rozdíly v obsahu CP i RFK vlivem odrůdy a stanoviště, zatímco vliv stárnutí byl neprůkazný v r. 1996 i 1997.

U hrachu byly zjištěny průkazné rozdíly v obsahu CP vlivem odrůdy, ošetření a stanoviště, v r. 1996 i v r. 1997. Nárůst obsahu isoflavonoidních látek vlivem ošetření byl spíše neprůkazný v obou sledovaných létech. Odrůda a stanoviště měly prokazatelný vliv na obsah těchto látek v obou sledovaných létech. Odrůda Menhir v obou sledovaných létech dosahuje nižšího obsahu isoflavonoidních látek o 30-50 % rel. než odrůdy Komet a Lantra.

Byly sledovány změny obsahu celkových polyfenolických sloučenin v naklíčených semenech ječmene i hrachu setého vlivem elicitorů houby Epicoccum purpurascens. Obsahy CP byly v naklíčených rostlinách podstatně vyšší ve srovnání s obsahem v semenech (např. 1271,3 mg/100 g u ječmene naklíčeného na sterilní vodě a 245,1 mg /100 g u hrachu. Obsah celkových polyfenolů byl stanoven jak ve sterilní kontrole tak i v naklíčených semenech kultivovaných na hrachové půdě po kultivaci E. purpurascens bez následovné sterilizace a po sterilizaci. Obsah polyfenolických látek byl sledován na různých mediích. Elicitory E. purpurascens způsobují nárůst obsahu fytoalexinů fenolické povahy. Vysoký nárůst byl zjištěn u nesterilizovaných medií po kultivaci E. purpurascens. Fytoalexiny fenolické povahy mohou hrát důležitou roli v obranném mechanismu hrachu, což potvrzuje zvýšená akumulace jejich hladiny po kultivaci na hrachové půdě inokulované E. purpurascens a na vodném fitrátu houby E. purpurascens. To potvrzuje i pozitivní korelaci mezi hladinami dormance a obsahem fenolických sloučenin a vlivem prostředí, závislost na podmínkách skladování a komplexních genetických interakcích (genotyp x fenotyp) v obilovinách a hrachu (OBERTHUR et al., 1995, WEIDNER et al., 1996).

Závery

Deteriorací semen hrachu i ječmene dochází k nárůstu CP, zejména u hrachu, významné jsou meziodrůdové a lokalitní rozdíly. Deteriorovaná suchá semena měla průkazně sníženou klíčivost. V obalových vrstvách ječmene odrůdy Forum byly stanoveny nejvyšší obsahy CP a RFK a také nejmenší reakce na stresové podmínky při klíčení. Tento trend je nutno prověřit ve více ročnících. Z hrachu (odrůdy Menhir, Lantra) stárnutím výrazně narůstá obsah CP a reaktivita 4-daidzenu v obou sledovaných letech, významný je vliv odrůdy, lokality i ročníku.

Elicitory E. purpurascens Ehrenb. ex Schlecht. zvyšovaly obsah CP a RFK u ječmene a zvláště obsah CP u hrachu.

LITERATURA

ESCUREDO, P.R. - MINCHIN, F.R. - GOGORCENA, Y. - ITURBE-ORMAETXE, I. - KLUCAS, R.V. - BECANA, M.:Involvement of activated oxygen in nitrate-induced senescence of pea root nodules. Plant. Physiol., 1996, 110:1187-1195

HENDRICH, S. - LEE, K.W. - XU, X. - WANG, H.J. - MURPHY, P.A.: Defining food components as new nutrients. Journal of Nutr. 124, 9 Suppl., 1994: 1789-1792

LAPČÍK, O. - HAMPL, R. - AL-MAHARIK, N. - SALAKKA, A. - WÄHÄLÄ, K. -ADLERCREUTZ, H.: A novel radioimmunoassay for daidzein. Steroids, 62, 1997:315-320

MAILLARD, M.N. - SOUM, M.H. - BOIVIN, P. - BERSET, C. : Antioxidant activity of barley and malt : relationship with phenolic content. Lebensm.-Wiss.u.-Technol., 1996, 29 : 238-244

OBERTHUR, L. - BLAKE, T.K. - DYER, W.E. - ULLRICH, S.E. : Genetic analysis of seed dormancy in barley (Hordeum vulgare L.). J. Quant. Trait Loci (Electronic Publication), 1995, Avail. URL : http : //probl.nalusda.gov:8000/otherdocs/jqtl/jqtl 1995-05/ dormancy.html

PIVEC, V. - LACHMAN, J. - ŘEHÁKOVÁ, V.: Flavonoidy a sacharidy v semenech čočky (Lens esculenta Moench.). Sb. VŠZ Praha, AF, řada A , 55, 1993 :55-63

TE KRONY, D..M.:Acelerated ageing test ISTA. Seed Vigor Testing Handbook. 1995, AOSA

WEIDNER, S. - PAPROCKA, J. - LUKASZEWICZ, D.: Changes in free, esterified and glycosidic phenolic acids in cereal grains during the after-ripening. Seed Sci.& Technol., 1996 (24):107-114

Tato práce byla řešena za podpory grantu GA ČR 521/96/0616 a GA ČR 311/67/468

Tab. I. A Průměrné hodnoty obsahu polyfenolických látek v hrachu v r. 1997

Tab. I. B Průměrné hodnoty obsahu polyfenolických látek v hrachu v r. 1996

Tab. II. Průměrné hodnoty obsahu polyfenolických látek v ječmeni