MOŽNOSTI VYUŽITÍ RAPD MARKERŮ PRO VYHODNOCENÍ GENOTYPOVÉ UNIFORMITY ODRŮD ZELENIN

Possibilities of RAPD markers for evaluation of genotype uniformity in vegetable

Varieties

Dr. Ing. Sylva Skupinová

ČZU v Praze

Abstract

For the evaluation genotype uniformity by RAPD markers two models crops were selected - carrot (Daucus carota L.), creating varieties of population type and F1 hybrid, and pea setý (Pisum sativum L.), creating varieties of pure line type. From the set of studied plants DNA was isolated, used for RAPD reaction. Both the basic component composition and temperature and time RAPD profile were optimised. After the electrophoretical separation and following visualisation in the presence of SYBR Gold dye the electrophoreograms were digitalised and computed by the program GelManager for Windows. Genotype variability was expressed by Dice coefficient of similarity. The values of this coefficient ranged in individual carrot varieties from 59,8% to 82,4% in pea the genotype variability of studied RAPD was not detected.

vegetables, genotype uniformity, RAPD markers

Úvod

Nejvýznamnějším genetickým, tedy vnitřním, faktorem v rámci druhu je odrůda. Odrůda je podle mezinárodního kódu definována jako záměrně pěstovaný porost vyznačující a odlišující se od jiné odrůdy závažnými morfologickými, fyziologickými, cytologickými, chemickými, hospodářskými nebo jinými znaky a vlastnostmi, které jsou pro něj typické a které si při pohlavním nebo nepohlavním množení zachovává. Odrůda je tedy výsledkem záměrné šlechtitelské práce a je šlechtěna tak, aby odpovídala určitému šlechtitelskému cíli, jímž je komplex hospodářských vlastností a vhodnost pro určité půdní a klimatické podmínky. Odrůda se stává v současné době nejdůležitějším intenzifikačním faktorem a zvláště hybridní odrůdy splňují požadavky pěstitelů na moderní odrůdu.

U odrůd zelenin rozlišujeme v současné době tři nejdůležitější typy odrůd a to odrůdu - populace, odrůdu čistá linie a odrůdu - F1 hybrid. Odrůda - populace je soubor systematicky shodných, avšak geneticky různě založených jedinců. Odrůda - čistá linie je soubor homozygotních jedinců s uniformním genotypem a odrůda - F1 hybrid je souborem jedinců F1 generace po křížení imbreedních (homozygotních) linií s předem ověřenou kombinační schopností.

V současné době se využívá k objektivní a spolehlivé identifikaci genotypů, a tudíž i odrůd, technik založených na analýzách nukleových kyselin. Mezi tyto markerovací metody patří také RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - náhodná amplifikace polymorfní DNA), která je založená na PCR (Polymerase Chain Reaction - polymerázová řetězová reakce). Podstatou této metody je polymorfismus in vitro amplifikované DNA (deoxyribonukleové kyseliny), která je produktem termostabilních DNA-polymeráz. Princip amplifikace popisují například Chein et al. (1976), Sambrook et al. (1989) a Williams et al. (1990).

RAPD metody markerování představují světový trend většiny biologicko-genetických odvětví. Studium genetické skladby různých typů odrůd (populace, linie, F1 hybrid) vybraných druhů zelenin pomocí DNA markerů je přesnou metodou pro stanovení odrůdové pravosti, genotypové uniformity a současně je výchozí podmínkou pro markerování mnoha hospodářsky důležitých znaků. RAPD markery byly uspěšně využity pro identifikaci odrůd mnoha zemědělských plodin. U zelenin použili tuto metodu například u brokolice a květáku Hu - Quiros (1991), u cibule a jiných liliovitých Wilkie et al. (1993), u rajčete Kaemmer et al. (1995), u řepy Uphoff - Wricke (1992) a Jung et al. (1993). Rom et al. (1995) použil RAPD markery pro kontrolu genotypové čistoty tří F1 hybridů rajčat a jejich rodičovských linií. RAPD metodu použili pro “fingerprinting” rajčat rovněž Klein-Lankhorst et al. (1991). RAPD markery pro genotypovou identifikaci devíti linií a tří F1 hybridů mrkve použil Grzebelus et al. (1997).

Materiál

Pro pokus, jehož cílem bylo ověřit genotypovou uniformitu různých typů odrůd RAPD markery, byly zvoleny dvě modelové plodiny a to mrkev obecná (Daucus carota L.) a hrách setý (Pisum sativum L.). Celkem bylo analyzováno sedm odrůd mrkve (pět odrůd typu F1 hybrid a dvě odrůdy typu populace) a dvě odrůdy hrachu (odrůdy typu čistá linie).

Metoda

Od každé sledované odrůdy bylo metodou prostého náhodného výběru vybráno 25 klíčních rostlin u mrkve a 29 klíčních rostlin hrachu pro izolaci deoxyribonukleové kyseliny (DNA). DNA byla izolována modifikovanou metodou podle Maroofa (1988) za použití CTAB (cetyltrimetyl-bromidu amonného) extrakčního pufru. Izolovaná DNA byla UV - spektrofotometricky kvantifikována a ředěna na konstantní koncentraci 0,01m g.m l-1. Kvalita DNA byla testována na agarózové nedenaturační horizontální elektroforéze. Otestovaná DNA byla použita pro reakci náhodné amplifikace polymorfní DNA (RAPD), která byla optimalizována. Teplotní a časový profil RAPD reakce byl modifikován podle Grzebelus et al. (1997).

Produkty RAPD reakce byly elektroforeticky separovány na agarózové nedenaturační horizontální elektroforéze a vizualizovány. Obecné principy separace RAPD markerů pomocí horizontální agarózové elektroforézy uvádí (Saiki, 1989). Pro vizualizaci RAPD produktů bylo použito barvivo SYBR Gold, které bylo naneseno přímo do vzorků jednotlivých RAPD produktů před elektroforetickou separací. Vizualizace RAPD produktů proběhla ozářením UV paprsky na UV transiluminátoru. Vizualizované elektroforeogramy byly fotografovány, digitalizovány a zpracovány počítačovou analýzou obrazu. Pro zpracování dat byly použity barevně invertované obrázky elektroforeogramů. Pro statistické zpracování dat bylo využito počítačového programu GelManager for Windows.

Výsledky

Výsledkem izolace DNA z klíčních rostlin mrkve i hrachu byla vysokomolekulární DNA. Izolovaná a otestovaná DNA byla použita jako templátová DNA pro reakci náhodné amplifikace polymorfní DNA (RAPD), při které bezproblémově amplifikovala.

Pro RAPD reakce bylo celkem testováno 20 primerů. Pro mrkev byl vybrán ssDNA primer se sekvencí bází 5`- CCCACTGACG - 3`, pro hrách 5`- ACCACCCACC - 3`. Oba vybrané primery byly nejvíce specifické pro analyzovanou DNA, tj. vykazovaly nejvyšší počet ostrých zón dobře oddělitelných od sebe. Byla vyhodnocena optimální koncentrace templátové dsDNA 10ng a koncentrace vybraného primeru 0,5m M v reakční směsi pro 25m l RAPD reakci a dále optimální kombinace koncentrací těchto komponent reakční směsi v kombinaci s optimální koncentrací MgCl2 2,5mM, taktéž pro 25m l RAPD reakci. Na základě výsledků optimalizace koncentrací jednotlivých komponent byla sestavena kompletní reakční směs pro 25m l RAPD reakci. Byla vyloučena možnost tzv. “autoprimeringu” a dále byla vyloučena amplifikace nespecifických DNA fragmentů s velikostí nad 398bp. Byl prokázán polymorfismus RAPD produktů, které vznikaly amplifikací s vybraným primerem.

Z elektroforeogramů RAPD produktů jednotlivých odrůd mrkví i hrachu byl vyhodnocen rozsah genotypové variability RAPD produktů na základě výpočtu podobnostních matic Diceho podobnostních koeficientů. Z vypočítaných hodnot Diceho podobnostních koeficientů byly sestaveny pro všechny sledované odrůdy podobnostní matice, ze kterých byly dále vypočítány průměrné hodnoty Diceho podobnostních koeficientů jednotlivých odrůd. Z tabulek 1 a 2 vyplývá, že průměrné hodnoty Diceho podobnostních koeficientů jednotlivých odrůd se pohybovaly od 59,8% do 82,4% u mrkve a u obou testovaných odrůd hrachu 100%.

Pro příklad elektroforeogramu RAPD produktů odrůdy typu F1 hybrid byla vzorově vybrána odrůda mrkve Jaguár (obrázek č. 1), pro příklad odrůdy typu populace byla vzorově vybrána odrůda mrkve Nanteská (obrázek č. 2), pro příklad odrůdy typu čistá linie byla vzorově vybrána odrůda hrachu Menhir (obrázek č. 3).

Tab. 1:Průměrné hodnoty Diceho koeficientů podobnosti jednotlivých odrůd mrkve a jejich směrodatné odchylky vypočtené z podobnostních matic

Tab. 2:Průměrné hodnoty Diceho koeficientů podobnosti jednotlivých odrůd hrachu a jejich směrodatné odchylky vypočtené z podobnostních matic

Obrázek 1

Elektroforeogram RAPD produktů souboru 25 analyzovaných rostlin

mrkve (Daucus carota L.) - odrůda Jaguár F1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 S -

+

1 - 25 dráhy elektroforeogramu odpovídají RAPD produktům

jednotlivých analyzovaných rostlin

S - hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Obrázek 2

Elektroforeogram RAPD produktů souboru 25 analyzovaných rostlin

mrkve (Daucus carota L.) - odrůda Nanteská

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 S -

+

1 - 25 dráhy elektroforeogramu odpovídají RAPD produktům

jednotlivých analyzovaných rostlin

S - hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Obrázek 3

Elektroforeogram RAPD produktů souboru 29 analyzovaných rostlin

hrachu (Pisum sativum L.)- odrůda Menhir

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 S -

+

1 - 29 dráhy elektroforeogramu odpovídají RAPD produktům

jednotlivých analyzovaných rostlin

S - hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Diskuse a záver

Modifikovaná metodika izolace DNA poskytovala kvalitní vysokomolekulární DNA, která bezproblémově amplifikovala. Výsledkem RAPD reakcí, u kterých bylo optimalizováno složení všech základních komponent reakce a teplotního a časového profilu reakce, byly po elektroforetické separaci s následnou vizualizací, elektroforeogramy vysoké kvality. Barvení RAPD produktů barvivem SYBR Gold umožnilo vyšší kvalitu digitalizovaných elektroforeogramů a tím i přesnější vyhodnocení genotypové variability v rámci jednotlivých rostlin téže odrůdy programem Gel Manager for Windows. RAPD markery byly shledány vhodným DNA markerem pro vyjádření genotypové variability mezi jednotlivými rostlinami téže odrůdy. Z průměrných hodnot Diceho podobnostních koeficientů lze hodnotit genotypovou variabilitu hodnoceného RAPD markeru uvnitř odrůd typu F1 hybrid, populace i čistá linie. Byla prokázaná poměrně vysoká variabilita sledovaného RAPD markeru u odrůd typu F1 hybrid mrkve (hodnota Diceho podobnostního koeficientu byla u odrůdy Troika pouze 59,8%). Tato variabilita hodnocených genotypů je pravděpodobně způsobena šlechtitelskými aspekty tvorby F1 hybridních odrůd druhu mrkev, který má vysoké sklony k imbreední depresi (Riggs, 1988). Je samozřejmé, že odrůdy typu populace budou jistou variabilitu ve sledovaném RAPD markeru vykazovat, což bylo pokusem potvrzeno. Naopak nebyla ve sledovaném RAPD markeru nalezena variabilita u samosprašného druhu hrách.

Z výsledků pokusu plyne, že RAPD markery lze využít pro vyhodnocení genotypové uniformity odrůd zelenin různých typů. Nedílnou součástí uvedeného experimentu je však optimalizace složení RAPD reakce, zejména pak výběr vhodného ssDNA primeru, který bude poskytovat dostatečné množství polymorfních zón. Tato metoda by jistě byla aplikovatelná i na jiné zemědělsky důležité plodiny a může přispět k objasnění nevyrovnanosti některých hospodářsky důležitých znaků v rámci odrůd.

Literatura

Grzebelus, D. - Szklarczyk, M. - Michalik, B.: The use of RAPD markers for genotype identification of carrot lines and F1 hybrids. Journal of applied genetics, 38a, 1997, 33-41.

Hu, J. - Quiros, C. F.: Identification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD markers. Plant Cell Reports, 10, 1991, 505-511.

Chein, A. - Edgar, D. B. - Trela, J.M. : Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J. Bacteriol., 127, 1976, 1550.

Jung, C. - Pillen, K. - Frese, L. - FÄ hr, S. - Melchinger, A. E.: Phylogenetic relationships between cultivated wild specios of the genus Beta revealed by DNA “fingerprinting”. Theor. Appl. Genet., 86, 1993, 449-457.

Kaemmer, D. - Weising, K. - Beyermann, B. - BÖ rner, T. - Epplen, J. T. - Kahl, G.: Oligonucleotide fingerprinting of tomato DNA. Plant Breeding, 114, 1995, 12-17.

Klein-Lankhorst, R. M. - Vermunt, A. - Weide, R. - Liharska, T. - Zabel, P.: Isolation of molecular markers for tomato (L. esculentum) using random amplified polymorphic DNA (RAPD). Theor. Appl. Genet., 81, 1991, 661-667.

Maroof, S. M. A. - Soliman, K. M. - Jorgenson, R. A. - Allard, R. W.: Ribosomal DNA spacer lenght polymorphism in barley: Mendelianinheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proc Natl Acad Sci USA 81,1988, 8014-8018.

Riggs, T. J.: Breeding F1 hybrid varieties of vegetables. Journal of Horticultural Science, 63, 1988, 3, 369-382.

Rom, M. - Bar, M. - Rom, A. - Pilowsky, M. - Gidoni, D.: Purity control of F1-hybrid tomato cultivars by RAPD markers. Plant Breeding, 114, 1995, 188-190.

SAIKI, R. K. - GELFAND, D. H.: Introduction AmpliTaq DNA polymerase. Amplification (Perkin Elmer Cetus), 1, 1989, 4.

Sambrook, J. - Maniatis, T. - Fritsch, E.F.: Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.

Uphoff, H. - Wricke, G.: Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in sugar beet (Beta vulgaris L.). Plant Breeding, 109, 1992, 168-171.

Wilkie, S. E. - Isaac, P. G. - Slater, R. J.: Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers for genetic analysis in Allium. Theor. Appl.Genet., 86, 1993, 497-504.

Williams, J. G. - Kubelik, A. R. - Livak, K. J. - Rafalski, J. A. - Tingey, S. V.: DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleid Acid Res., 18, 1990, 6531-6535.