GENETICKÉ MARKERY ZALOŽENÉ NA PRINCIPU POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE VE ŠLECHTĚNÍ A SEMENÁŘSTVÍ PŠENICE OBECNÉ

Genetic Markers Based on the Principe of Polymerase Chain Reaction in Breeding and Seeds Production of Wheat

Dr. Ing. Pavel Vejl

ČZU v Praze

Abstract

Genetic markers based on Polymerase Chain Reaction were applied at A4 generation of the winter wheat dihaploid lines. The dihaploid lines were inducted by means of the method in vitro cultivation of the intact anthers (Ouyang et al., 1973 and Wang and Chen, 1983). DNA was isolated by modified method according Saghai-Maroof et al. (1984) and Vejl (1998). RAPD reactions and electrophoretical separation of the specific markers for the dihaploid lines were realised according Vejl (1998). Eight of polymorphic RAPD markers were obtained and all the analysed dihaploid lines were differentiated. To mark baking quality of the dihaploid lines, PCR markers were used which enabled to detect the presence or absence of 1BL/1RS rye translocation in the Triticum aestivum L. genome (Francis et al., 1995 and Van Campenhout et al., 1995) and which enabled to detected the presence of 1Dx5-1Dy10 allele in a Glu-1D locus (DOvidio and Anderson, 1994). Results of marking by means of SPLAT (Specific Polymorphic Locus Amplification Test) markers of A4 generation of dihaploid lines derived from F1: Florida x Ilona were exactly the same as the results of marking identical lines of A3 generation by means of suitable protein markers (Černý and Šašek, 1995).

Wheat, Triticum aestivum L., Dihaploid Lines, DNA Markers, Polymerase Chain Reaction, Random Amplified Polymorphic DNA, Specific Polymorphic Locus Amplification Test, Fingerprinting, Baking Quality

1. ÚVOD

Obiloviny jsou významným celosvětovým zdrojem lidské potravy a jsou proto řazeny mezi nejdůležitější kulturní plodiny. V našich klimatických podmínkách mají v oblasti lidské výživy největší význam tzv. chlebové obilniny, především potravinářská pšenice. V současné době jsou konvenční šlechtitelské postupy u této plodiny vhodně doplňovány moderními technikami využívajícími in vitro kultury a metody genového inženýrství. V tomto příspěvku jsou naznačeny dvě možnosti využití těchto moderních postupů - indukce dihaploidních linií a aplikace genetických markerů založených na polymorfismu DNA.

Indukce dihaploidních linií pšenice - androgeneze

Androgeneze v prašníkových kulturách představuje proces, kdy haploidní rostlina pšenice je indukována kultivací celých prašníků v in vitro podmínkách. Možný vznik haploidů na všech úrovních vývoje gametofytu uvádí například Kasha (1974). U pšenice (Triticum aestivum L.) byla první haploidní rostlina vzniklá androgenezí získána v roce 1973 (Ouyang et al., 1973). Využití dihaploidie umožňuje zkrácení šlechtitelského procesu pšenice o 4 - 5 let. Této zkušenosti bylo využito při tvorbě dihaploidních odrůd pšenice v Číně (Hu et al., 1983), Francii (Henry a DeBuyser, 1990), Kanadě (Simmonds et al., 1993) a v Maďarsku (Pauk et al., 1995).

Genetické markery založené na polymorfismu DNA

Pokrok v oblasti biochemie a molekulární biologie umožnil aplikace dalšího typu biochemicko-genetických markerů - markery založené na polymorfismu DNA. Společným znakem DNA markerů je přímá schopnost detekce alelických variant v sekvenci nukleotidů. DNA markery jsou založeny na délkovém polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP, Restriction Lenght Polymorphism) a na polymerázové řetězové reakci (PCR, Polymerase Chain Reaction). Metody založené na polymerázové řetězové reakci je možno rozdělit na amplifikace specifických polymorfních lokusů (SPLAT, Specific Polymorphic Locus Amplification Test) a na náhodnou amplifikaci polymorfní DNA (RAPD) (Gale a Witcombe, 1992). Použití DNA markerů ve šlechtitelském procesu shrnují Gale a Witcombe (1992) následovně:

a) “Fingerprinting” - detekce rozdílů mezi genotypy

b) Selekce na základě DNA markerů

c) Odhad kombinační schopnosti při heterózním šlechtění

V tomto příspěvku je uveden příklad možnosti využití metod založených na PCR (RAPD a SPLAT) ve “fingerprintingu” genotypů pšenice a detekce specifických lokusů (SPLAT) vhodných pro selekci na základě těchto markerů. Základním principem polymerázové řetězové reakce je amplifikace DNA v in vitro podmínkách. Objev termostabilní DNA polymerázy a následná automatizace procesu in vitro amplifikace DNA patentovaná K. B. Mullisem (U.S. patent 4,683,195, July 1987; U.S. patent 4,683,202, July 1987) znamenala rychlý rozvoj PCR markerů, umožňujících rutinní amplifikaci jediné molekuly DNA a detekci jedné kopie genu (Innis a Gelfand, 1990).

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) představuje amplifikaci DNA s jedním náhodným primerem (přibližně 6-12 bází) náhodně hybridizujícím s templátovou DNA. Výhoda RAPD spočívá ve velké rychlosti analýz a detekci polymorfismů a v možnosti testování vysokého počtu primerů současně. RAPD markery v genetice pšenice a ječmene použili mimo jiné Demeke et al. (1996), Dweikat et al. (1993), Francis et al. (1995), Hartl et al. (1995), Horvath et al. (1995), Iqbal a Rayburn (1995), Penner et al. (1995), Poulsen et al. (1995), Procunier et al. (1995), Riede et al. (1994), Schachermayr et al. (1994), Schachermayr et al. (1995), Vejl (1997a), Vejl (1997c), Vierling a Nguyen (1992), Wang et al. (1995), Wight et al. (1994) a William et al. (1994).

SPLAT (Specific Polymorphic Locus Amplification Test) představuje původní typ PCR, kdy dochází k amplifikaci dvěma primery definovaného lokusu (Gale a Witcombe, 1992). Výhody metody spočívají v poměrně velké rychlosti analýz, v nepoužívání radioizotopů a v malém množství výchozí genomové DNA. Nevýhoda spočívá v obtížném získávání správných sekvencí primerů (Gale a Witcombe, 1992). V genetickém výzkumu pšenice a ostatních obilovin SPLAT použili například D´Ovidio a Anderson (1994), D´Ovidio et al. (1995), Chunwongse et al. (1993), Ko et al. (1994), Ko et al. (1996), Koebner (1995), Lee et al. (1994), Lee et al. (1995), Smith et al. (1994) a Van Campenhout et al. (1994).

2. MATERIÁL A METODY

Indukce dihaploidních linií pšenice

Pro získání výchozí hybridní generace (F1 nebo F3) byl proveden výběr rodičovských genotypů ozimé pšenice (Triticum aestivum L.) na základě těchto kritérií: vysoká pekařská jakost vysoká androgenní responzivita - schopnost poskytovat dihaplodní linie, vhodné hospodářské a agrotechnické vlastnosti, vysoká odolnost vůči biotickým a abiotickým faktorům. Jako donor vysoké responzivity byla použita odrůda Florida. Křížení bylo provedeno podle mexického způsobu - “twirl method” , který uvádějí například Habětínek a Graman (1984).

Dihaploidní linie byly odvozeny z následujících hybridních kombinací:

F1: Florida x Bussard F3: Hana x Siria

F1: Florida x Hana F3: Samanta x Apollo

F1: Florida x Ilona

F1: Florida x Jantar 50

F1: Florida x ST950-89

Haploidní rostliny byly získány metodou androgeneze - kultivací celých prašníků (Ouyang et al., 1973). Pro indukci haploidních kalusů bylo použito upravené C17 tuhé agarové médium (Wang a Chen, 1983) s 1,5mg.l-1 2,4-D a 0,5mg.l-1 kinetinu. Indukce kalusů probíhala ve tmě při konstantní teplotě 28oC po dobu 4 - 8 týdnů. Regenerace zelených rostlin probíhala na upraveném C17 tuhém agarovém médium (Wang a Chen, 1983) s 1,0mg.l-1 NAA a 1,0mg.l-1 kinetinu při periodě osvětlení: 8 hodin tma, 16 hodin světlo, intenzitě osvětlení 2000-3000lx, teplotě 24-25oC a relativní vzdušné vlhkosti 60-70%. Jarovizace rostlin probíhala v in vitro podmínkách při periodě osvětlení: 8 hodin tma, 16 hodin světlo, intenzitě osvětlení 2000-3000lx, teplotě 4oC po dobu 50 dnů. Stanovení ploidie regenerantů bylo provedeno mikroskopicky podle metody, kterou uvádí například Waninge (1965) a Kučera a Jakubková (1982). Dihaploidie byla navozena kolchicinem (Barnabás et al., 1991).

Genetické markery založené na principu PCR

DNA byla izolována modifikovanou metodou dle Saghai-Maroof et al. (1984). Modifikaci metody detailně popisuje Vejl (1998). Pro kvantifikaci DNA (stanovení koncentrace) bylo využito UV spektrofotometrické metody. Kvalita izolované DNA (vysokomolekularita) byla ověřena pomocí elektroforetické separace v 1% agarózovém gelu na horizontální elektroforéze.

Formou dialelních kombinací bylo optimalizováno složení RAPD reakce (koncentrace templátové DNA, primeru, MgCl2, termostabilní DNA polymerázy) a teplotní a časový profil amplifikace. Z celkového počtu 58 primerů (8 - 13 bází) byly vybrány primery poskytující genotypově specifické produkty. Pro RAPD bylo použito optimalizovaných postupů a postupů, které uvádí Myburg et al. (1997), Riede et al. (1994), Van Campenhout et al. (1995) a DOvidio a Anderson (1994). RAPD markery byly separovány pomocí horizontální agarózové elektroforézy (Vejl, 1998).

Pro markerování pekařské jakosti byl použit RAPD marker pro přítomnost žitné translokace 1RS/1BL v genomu Triticum aestivum L. (Francis et al. 1995), SPLAT marker pro přítomnost žitné translokace 1RS/1BL v genomu Triticum aestivum L. (Francis et al. 1995), SPLAT marker pro absenci žitné translokace 1RS/1BL v genomu Triticum aestivum L. (Van Campenhout et al. 1995) a SPLAT marker pro detekci alelického páru 1Dx5-1Dy10 v lokusu Glu-D1 kódujícího gluteninové podjednotky s vysokou molekulovou hmotností (DOvidio a Anderson, 1994). Pro amplifikaci těchto markerů byly použity metodiky výše citovaných autorů.

Komplexní vyhodnocení variability mezi dihaploidními liniemi odvozenými ze shodného hybrida pomocí všech RAPD a SPLAT markerů bylo provedeno s využitím programu GelManager for Windows. Způsob zadávání binárních dat do tohoto programu uvádí Vejl (1998). Při vyhodnocování elektroforeogramů tímto programem (Diceho podobnostní koeficienty, shluková analýza) bylo použito postupu, který uvádí Jackman (1994).

3. VÝSLEDKY A DISKUSE

Indukce dihaploidních linií pšenice

Z jednotlivých výchozích hybridních kombinací byly získány následující počty fertilních dihaploidních regenerantů generace A1:

F1: Florida x Bussard 35 fertilních regenerantů A1 generace

F1: Florida x Hana 17 fertilních regenerantů A1 generace

F1: Florida x Ilona 71 fertilních regenerantů A1 generace

F1: Florida x Jantar 50 6 fertilních regenerantů A1 generace

F1: Florida x ST950-89 45 fertilních regenerantů A1 generace

F3: Hana x Siria 17 fertilních regenerantů A1 generace

F3: Samanta x Apollo 16 fertilních regenerantů A1 generace.

Úspěšnost procesu androgeneze byla charakterizována mimo jiné těmito průměrnými parametry (hodnota variačního koeficientu odpovídá variabilitě způsobené genotypem donorových rostlin):

- průměrná relativní responzivita prašníků: 12,5% Vk = 54,1%

- průměrná relativní četnost albinotických regenerantů: 9,7% Vk = 91,0%

- průměrný počet zelených regenerantů

vzniklých ze 100 prašníků: 0,40 Vk = 45,4%

- průměrná relativní četnost spontánních dihaploidů 56,7% Vk = 8,3%

- průměrný počet fertilních klasů regeneranta A1 generace: 3,9 Vk= 10,0%.

Proces androgeneze je názornost dokumentován fotografií 1. Celková úspěšnost procesu indukce dihaploidie pšenice byla závislá zejména na genotypu donorových rostlin (hybridních kombinací). Tyto výsledky jsou v plném souladu se závěry, ke kterým dospěli autoři citovaní v úvodní části příspěvku. Pro uplatnění těchto metod v praktickém šlechtění je rovněž významná výrazná redukce počtu materiálů během indukce dihaploidů a statisticky průkazný vliv lidského faktoru na úspěšnost procesu tvorby dihaploidních linií (Vejl, 1998).

Fotografie 1: Indukce dihaploidů - a) prašník pšenice (Triticum aestivum L. po 50-ti dnech kultivace na indukčním médiu C17 (zvětšení 31,3x), b) - regenerace haploidní rostliny po 10-ti dnech kultivace na regeneračním médiu C17 (zvětšení 22,5x)

a) b)

“Fingerprinting” genotypů pšenice metodami založenými na PCR

Pro RAPD bylo navrženo následující chemické složení:

templátová DNA 7,0ng.25m l-1

primer 300mM

dNTP 400m M

MgCl2 3,0mM

Taq polymeráza 0,7U.25m l-1

Pro RAPD byl navržen následující teplotní a časový profil:

cyklus první denaturace (1x): denaturace 94,0oC, 180s

“annealing” 37,5oC, 100s

prodlužování 72,0oC, 100s

vlastní amplifikace (35): denaturace 94,0oC, 60s

“annealing” 37,5oC, 100s

prodlužování 72,0oC, 120s

závěrečné prodlužování (1x): prodlužování 72,0oC, 600s

uchovávání produktů: 4oC.

Genotypová specificita RAPD markerů a výskyt nespecifických amplifikací byl ovlivněn sekvencí primeru. Polymorfní RAPD produkty, nezatížené nespecifickými amplifikacemi, poskytovalo u souboru dihaploidních linií A4 generace odvozených z F1: Florida x Ilona 8 primerů o délce 8 - 10 bází. Celkem bylo detekováno 19 polymorfních zón, pomocí kterých se podařilo odlišit 29 linií A4 generace pocházejících z výše uvedeného výchozího hybrida. Sekvence primerů, které poskytovaly genotypově specifické produkty jsou:

T5 5-GAA CGG AC-3

T42 5-CCC ACT GAC G-3

T43 5-CCC ACT GAC G-3

T45 5-ACA CAC GCT G-3

T49 5-CAA ACG TCG G-3

T50 5-TGC CCG TCG T-3

T51 5-GTG CCT AAC C-3

T53 5-CCG CCT AGT C-3

Navržené složení a teplotní a časový profil RAPD reakce jsou srovnatelné s údaji, které uvádí například Demeke et al. (1996), Dweikat et al. (1993), Francis et al. (1995), Hartl et al. (1995), Horvath et al. (1995), Iqbal a Rayburn (1995), Penner et al. (1995), Poulsen et al. (1995), Procunier et al. (1995), Riede et al. (1994), Schachermayr et al. (1994), Schachermayr et al. (1995), Vejl (1997a), Vejl (1997c), Vierling a Nguyen (1992), Wang et al. (1995), Wight et al. (1994) a William et al. (1994).

Příklad RAPD polymorfismu detekovaného na agarózovém vertikálním gelu znázorňuje elektroforeogram 1.

Elektroforeogram 1: Barevně invertovaný elektroforeogram s RAPD produkty (primer T53 - 5-CCG CCT AGT C-3) souboru dihaploidních linií pšenice obecné (Triticum aestivum L.) A4 generace odvozených z F1 generace hybrida odrůd Florida x Ilona (polymorfní zóny 2200bp,1600bp a 570bp jsou označeny šipkou)

Dráhy elektroforeogramu: A3 generace použitá pro získání generace A4

P1-Florida, P2-Ilona, 1-C1/1/2, 2-C2/2/2, 3-C3/1/1, 4-C3/1/2, 5-C41/1, 6-C4/1/2 , 7-C5/1/1, 8-C5/3/2, 9-C6/2/3, 10-C7/1/1, 11-C10/1/2, 12-C11/1/1, 13-C12/1/2, 14-C12/2/2, 15-C12/3/2, 16-C14/1/1, 17-C14/4/1, 18-C15/1/1, 19-C15/2/1, 20-C16/1/1, 21-C17/2/1, 22-C18/1/2, 23-C19/1/1, 24-C20/1/2, 25-C21/1/2, 26-C22/1/2, S-hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Byl vypracován grafický způsob zadávání binárních dat (přítomnost - absence polymorfní zóny) do programu GelManager for Windows, který umožnil komplexní vyhodnocení variability pomocí vyššího počtu markerů (Diceho podobnostní koeficienty, shluková analýza UPGMA). Tímto způsobem byly vzájemně odlišeny vysoce příbuzné genotypy pšenice - dihaploidní linie indukované ze shodné výchozí hybridní kombinace. Podobný způsob využití programu GelManger for Windows pro vyhodnocení většího počtu DNA markerů neuvádí žádný z citovaných autorů. Elektroforeogram 2 představuje vstupní binární údaje - DNA markery, které charakterizují variabilitu dihaploidních linií.

Elektroforeogram 2: Schéma teoretického uměle sestaveného komplexního elektroforeogramu pro charakteristiku variability dihaploidních linií A4 generace odvozených z F1: Florida x Ilona

Diceho podobnostní koeficienty získané vyhodnocením 21 polymorfních zón byly použity pro sestavení dendrogramu na obrázku 2, který graficky vyjadřuje genetické vzdálenosti mezi analyzovanými dihaploidními liniemi.

Obrázek 2: Dendrogram charakterizující variabilitu mezi dihaploidními liniemi pšenice (Triticum aestivum L.) generace A4 odvozenými z F1: Florida x Ilona

Detekce specifických lokusů PCR metodami umožňující markerování pekařské jakosti pšenice

Pro markerování pekařské jakosti dihaploidních linií bylo využito PCR markerů, které umožňují detekovat přítomnost nebo absenci 1BL/1RS žitné translokace v genomu Triticum aestivum L.:

- 1500 bp RAPD fragment markerující přítomnost translokace (Francis et al., 1995)

- 1500 bp SPLAT fragment markerující přítomnost translokace (Francis et al., 1995) - elektroforeogram 3

- 636 bp SPLAT fragment markerující absenci translokace (Van Campenhout et al., 1995) - elektroforeogram 4.

Markerování pekařské jakosti pomocí těchto markerů přímo u dihaploidních linií pšenice neuvádí žádný ze zahraničních citovaných autorů.

Elektroforeogram 3: Příklad SPLAT markeru 1500bp (Francis et al., 1995) pro přítomnost žitné translokace 1RS/1BL u souboru dihaploidních linií pšenice (Triticum aestivum L.) odvozených z F1 generace hybrida odrůd Florida x Bussard

8126 bp

1420 bp

985 bp

597 bp

Dráhy elektroforeogramu: A4 generace odvozená z těchto linií A3 generace

P1-Florida (1RS/1BL), P2-Bussard, 1-A1/1/1 (1RS/1BL), 2-A1/1/2 (1RS/1BL), 3-A1/2/1 (1RS/1BL), 4-A1/2/2 (1RS/1BL), 5-A2/2/1, 6-A2/3/1, 7-A3/1/1 (1RS/1BL), 8-A5/1/2 (1RS/1BL), 9-A6/1/1 (1RS/1BL), 10-A7/1/2 (1RS/1BL), 11-A8/1/2, 12-A8/2/1, S-hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII

Elektroforeogram 4: Příklad SPLAT markeru 636bp (Van Campenhout et al., 1995) pro absenci žitné translokace 1RS/1BL u souboru dihaploidních linií pšenice (Triticum aestivum L.) odvozených z F1 generace hybrida odrůd Florida x Bussard

8126 bp

1420 bp

985 bp

597 bp

433 bp

Dráhy elektroforeogramu: A4 generace odvozená z těchto linií A3 generace

P1-Florida (1RS/1BL), P2-Bussard, 1-A1/1/1 (1RS/1BL), 2-A1/1/2 (1RS/1BL), 3-A1/2/1 (1RS/1BL), 4-A1/2/2 (1RS/1BL), 5-A2/2/1, 6-A2/3/1, 7-A3/1/1 (1RS/1BL), 8-A5/1/2 (1RS/1BL), 9-A6/1/1 (1RS/1BL), 10-A7/1/2 (1RS/1BL), 11-A8/1/2, 12-A8/2/1, S-hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Pekařská jakost dihaploidních linií byla dále markerována 450 bp SPLAT fragmentem (DOvidio a Anderson, 1994) - elektroforeogram 6, který markeruje přítomnost alely 1Dx5-1Dy10 v lokusu Glu-D1. Tato alela kóduje vysokomolekulární podjednotky gluteninů, které mají pozitivní vliv na výslednou pekařskou jakost pšenice.

Elektroforeogram 5: Příklad SPLAT markeru 450bp (DOvidio a Anderson, 1994) pro detekci alely 5+10 v lokusu GLU 1D u souboru dihaploidních linií pšenice (Triticum aestivum L.) odvozených z F3 generace hybrida odrůd Samanta x Apollo

8126 bp

1420 bp

985 bp

597 bp

433 bp

Dráhy elektroforeogramu: A4 generace odvozená z těchto linií A3 generace

P1-Samanta, P2-Apollo, 1-G1/1/1, 2-G2/1/1, 3-G2/2/1, 4-G3/1/1, 5-G3/1/2, 6-G4/1/2, 7- G5/1/2 (1RS/1BL), S- hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Následně bylo ověřeno, že výsledky markerování pomocí SPLAT markerů A4 generace dihaploidních linií odvozených z F1: Florida x Ilona a výsledky markerování shodných linií generace A3 získané pomocí adekvátních bílkovinných markerů (Černý a Šašek, 1995) byly zcela shodné.

V tabulce 1 je shrnuta segregace výše uvedených SPLAT markerů v generaci A4. K segregaci docházelo pouze u SPLAT markerů pro žitnou translokaci 1RS/1BL.

Tab. 1: Segregace SPLAT markerů použitých pro markerování pekařské jakosti dihaploidních linií pšenice (Triticum aestivum L.) generace A4

Vysvětlivky: + přítomnost zóny - absence zóny

4. ZÁVER

Z výsledků experimentů, které sledovaly možnost využití genetických markerů při tvorbě dihaploidů pšenice (Triticum aestivum L.) lze vyvodit následující obecné závěry:

1. Indukce embryogenních kalusů z kultivovaných prašníků a následné regenerace intaktních rostlin je vhodný způsob pro získání dihaploidních linií pšenice obecné (Triticum aestivum L.) uplatnitelných ve šlechtitelském procesu.

1. Šlechtitelská úspěšnost dihaploidních linií je závislá zejména na:

- výběru vhodných rodičovských komponent

- počtu získaných fertilních homozygotních regenerantů z jednoho výchozího křížení

- hybridní generaci donorových rostlin

- počtu hybridních kombinací použitých k indukci dihaploidie

- kultivaci dihaploidních linií v polních podmínkách včetně prováděné selekce mezi jednotlivými liniemi.

2. Pro úspěšné zavedení genetických markerů založených na polymorfismu DNA je kromě odpovídajícího laboratorního vybavení nutné aplikovat jednotlivé metody do konkrétních podmínek nově vznikající laboratoře. Jedná se zejména o zavedení metod:

- izolace, purifikace a kvantifikace DNA

- vlastní amplifikace DNA

- elektroforetické separace amplifikované DNA

- vyhodnocování elektroforeogramů.

3. Po optimalizaci všech výše uvedených kroků je metoda RAPD vhodná pro posouzení rozsahu genetické variability nejen dihaploidních linií pšenice, ale rovněž i pro identifikaci odrůdové pravosti a čistoty v semenářské praxi a rovněž pro posouzení homogenity šlechtitelských materiálů v procesu tvorby nových odrůd.

4. Genetické markery (SPLAT) pekařské jakosti představují nedestruktivní metodu umožňující chrakteristiku genomu pšenice využitelnou v procesu selekce.

5. Výsledky markerování pekařské jakosti pomocí amplifikace specifických polymorfních lokusů (SPLAT), které byly použity pro detekci přítomnosti nebo absence 1RS/1BL žitné translokace v genomu pšenice a pro detekci 1Dx5-1Dy10 alely, zcela korelovaly s údaji stanovenými pomocí bílkovinných signálních genů.

LITERATURA

Přehled citovaných autorů je k dispozici u autora článku.