METODY MOLEKULÁRNÍ ANALÝZY - PŘECHOD NA VYŠŠÍ STUPEŇ ŠLECHTĚNÍ

Methods of Molecular Analysis

The Conversion on Higher Level of Plant Breeding

Pavel Vejl, Sylva Skupinová, Jiří Vopršal, Jiří Černý, Josef Habětínek

Česká zemědělská univerzita v Praze

Abstract

In this paper is presented overview of applicabled markers in plant breeding and seed production. Markers are easily detectabled chracters and treits which correlated with evaluating treit. In palnt breeding and seed control are aplicabled these markers: morphological-anatomical markers, biochemical-physiological markers, proteine markers, isozyme markers and DNA markers. The DNA markers (Restriction Fragment Length Polymorphism, Polymerase Chain Reaction, Random Amplified Polymorphic DNA, Amplification Fragment Length Polymorphism, Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, minisatellite, microsatellite and DNA sequencing,) show actual trend in breeding and seed control. Genetics markers are used in plant breeding for the Marker Assisted Selction, for inbreeding lines homogenity testing, for heterosis prediction and detection of transgenosis. These markers are also aplicated in seed production and seed control for distinctness, uniformity and stability testing and for control of seed and planting health.

markers, proteins, isoenzymes, DNA, RFLP, PCR, RAPD, CAPS, AFLP, SSR, sequencing, genome mapping, distinctness of varieties, uniformity of varieties, stability of varieties, marker assisted selection, plant breeding, seed production, seed control

Úvod

Vznik kulturních forem rostlin je založen na odvěké schopnosti člověka vybírat z původních planých druhů jedince s požadovanými vlastnostmi. Tito jedinci, kteří byli výsledkem rekombinačních mechanismů nebo spontánních mutací, se stávali základem dalších generací. Rozvoj lidské společnosti v období neolitu, který je spojený se vznikem prvních usedlostí pěstitelů a chovatelů, tak odstartoval proces domestikace rostlinných i živočišných druhů. První selekční postupy neolitického člověka byly mnohdy zcela neuvědomělé a nahodilé. Některá kritéria výběru byla v souladu s přírodním selekčním tlakem, jiná kritéria byla s tímto tlakem v rozporu. Později však byly uplatňovány čím dál tím vyšší měrou cílevědomé výběry vycházející ze stále hlubších zkušeností lidské civilizace.

Tímto postupem docházelo ve starověkých civilizacích k postupné domestikaci většiny plodin nezbytných pro výživu člověka. Různorodost forem - primitivních odrůd se neustále rozšiřovala. Výše popsaná záměrná selekce však nebyla podložena hlubším teoretickým základem. Zlomovým obdobím je konec 18. století, kdy Johan Gregor Mendel položil základy nového vědního oboru - genetiky. Tato vědní disciplina nalezla velice brzy své uplatnění i ve šlechtění rostlin.

Genetickými modely se u teoretických experimentů stávaly kulturní formy rostlin. Přímá aplikace poznatků základní genetiky do odrůdového šlechtitelství byla výsledkem prudkého rozvoje tohoto oboru. Klasická genetika tak umožnila aplikovat do šlechtění poznatky o monogenní i polygenní dědičnosti, o kvalitativních i kvantitativních znacích, o znacích volně kombinovatelných i znacích vzájemně vázaných, o mimojaderné dědičnosti, o dědivosti, o stabilitě populací, o mutacích genetické výbavy, atd.

Znalosti genetických mechanismů umožnily člověku odhadovat výsledky záměrně provedených křížení a napomáhaly mu k vytýčeným šlechtitelským cílům. Mnoho vlastností zemědělských plodin důležitých pro člověka však bylo možno správně posoudit a vyhodnotit až ke konci vegetačního období. Tato skutečnost byla důvodem studia korelačních vztahů mezi vlastní finální vlastností a vlastností jinou, která je vyhodnotitelná již třeba u juvenilních rostlin nebo přímo v množitelském materiálu. Tyto výzkumné snahy odstartovaly aplikace tzv. genetických markerů, které jsou definovány jako morfologické, anatomické, fyziologické nebo biochemicko-genetické vlastnosti organismů těsně korelující s jinými, mnohdy složitějšími, vlastnostmi.

Dalším zlomovým bodem v rozvoji biochemicko-genetických markerů byl rok 1954, kdy J. D. Watson a F. H. C. Crick sestavili model deoxyribonukleové kyseliny. Záhy byly objeveny jednotlivé části takzvaného “základního dogmatu molekulární genetiky” - například objev regulace genové aktivity F. Jacobem a F. Monodem v roce 1961, objev restrikčního modifikačního systému u bakteriální DNA W. Arberem v roce 1962, objev genetického kódu N. W. Nierenbergem v roce 1964 a jeho úplné dešifrování za spoluúčasti H. G. Khorana a R. W. Holleye v roce 1968. Rok 1970 je významným krokem v mapování genomu a v tvorbě prvních rekombinantních organizmů - D. Nathans, W. Arber a H. O. Smith zahájili mapování genomu viru a tvorbu prvních in vitro rekombinantů. Výše uvedené události jsou jen odrazovými body pro rozvoj vědní discipliny - molekulární genetiky. Současný rozvoj ostatních oborů, zejména biochemie, fyziologie, digitálních technologií, umožnil prudký rozvoj genetických markerů založených na polymorfismu nukleových kyselin. Této aktuální problematice je věnována i podstatná část příspěvku.

V předchozím odstavci je shrnut rozvoj discipliny základní. Aplikační oblasti genetiky, kam šlechtění a semenářství zcela jistě patří, prožily rovněž prudký rozmach. Tento progres byl odstartován využíváním indukované mutageneze, polyploidizace a vzdálené hybridizace. Následovalo i využití in vitro technik jak pro tvorbu dihaploidů a somatických hybridů, tak i využití těchto kultur pro tvorbu geneticky modifikovaných organismů - transgenních odrůd. Všechny výše uvedené postupy jsou příčinou neustále rostoucího počtu odrůd zemědělských plodin, které se fenotypově mnohdy minimálně odlišují. Nově se rozvíjející pěstební a zpracovatelské technologie kladou rovněž vysoké náklady na odrůdovou pravost a čistotu. Genetické markery se tudíž stávají vhodným způsobem, jak urychlit a zefektivnit proces tvorby nových odrůd a současně kontrolovat základní parametry množitelského materiálu - odlišitelnost, vyrovnanost a stálost.

Klasifikace markeru

Morfologicko-anatomické markery

Tyto markery vycházejí z existence závislosti různých znaků na morfologické a anatomické stavbě rostlin. Morfologicko-anatomické markery lze považovat z historického hlediska za nejstarší. Mnohdy byly využívány lidskými civilizacemi bez jakýchkoliv znalostí genetiky. Mezi tyto primitivní markery patří například korelace mezi kresbou na děložních lístcích okrasné rostliny fialy šedé (Mathiola incana) a plností jejích květů. Známý je rovněž empiricky ověřený vztah mezi červenou barvou révy chmele (Humulus lupulus L.) a jemně aromatickou kvalitou hlávek.

K historicky mladším morfologicko-anatomickým markerům patří například postupy využívající těsné korelace mezi velikostí svěracích buněk průduchů a stupněm ploidie daného rostlinného druhu.

Biochemicko-fyziologické markery

Biochemicko-fyziologické markery jsou založeny zejména na výběru jedinců podle jejich genetické výbavy, která jim umožňuje přežívat v záměrně zvolených selekčních podmínkách. K těmto markerům je možno zařadit plazmidové geny rezistence bakterií vůči antibiotikům, která jsou využívána při selekci transformovaných bakteriálních buněk.

Obdobným způsobem fungují různé selekční geny u geneticky modifikovaných rostlin, které umožní provádět selekci úspěšně provedených transformantů. Z hlediska biochemického byly dříve tyto markery založeny na získání rezistence rostliny vůči antibiotikům, v současnosti je úspěšná transformace markerována přenesením genu odolnosti vůči herbicidu.

Biochemicko-genetické markery

Biochemicko-genetické markery vycházejí ze základních principů genetického kódu. Historicky starší kategorie (zásobní proteiny a izoenzymy) jsou založeny na specificitě složení aminokyselin v analyzovaných proteinech. Většina aktuálně používaných markerů vychází z hodnocení variability nukleových kyselin.

Zásobní proteiny

Tyto markery jsou využívány zejména u obilovin - gliadiny a gluteniny pšenice, hordeiny ječmene a zeiny kukuřice. Sozinov a Poperelja (1979) je charakterizují následovně:

· jsou to prvotní genotypové produkty s nižší proměnlivostí a vyšší heritabilitou

· jsou unikátním produktem určitých genů

· vyznačují se kodominantní dědičností - umožňují vzájemně odlišit dominantního homozygota, heterozygota a recesivního homozygota

· dědí se v takzvaných blocích

· uvnitř bloků nedochází k rekombinacím

· vytvářejí mnohotný alelismus, který umožňuje postihnout variabilitu

· je známá jejich lokalizace na jednotlivých chromozómech.

Jsou využívány zejména pro markerování pekařské jakosti pšenice a sladařské jakosti ječmene. Mohou markerovat odolnosti pšenice vůči některým chorobám a abiotickým faktorům. Jsou využívány rovněž pro stanovení odlišitelnosti, vyrovnanosti a stálosti odrůd a šlechtitelských materiálů nebo pro určení pravosti merkantilu.

Izoenzymy

Izoenzymy neboli izozymy neboli allozymy jsou z historického hlediska novějším typem proteinových markerů. Obecně jsou založeny na skutečnosti, že jeden enzym není tvořen pouze jedním typem molekul, ale více molekulami. Tyto izomolekuly se liší mimo jiné svou velikostí, ale spojuje je základní definice enzymu - schopnost vytvářet ze stejného substrátu stejný produkt. Jejich charakteristiku shrnuje Nielsen (1985) do následujících bodů:

· mají vysoký stupeň geneticky vázaného polymorfismu

· jsou kodominantní

· umožňují rozlišení alel v individuích

· jsou nezávislé na vnějších podmínkách.

Mezi jejich negativní vlastnosti patří vysoká tkáňová a ontogenetická specificita. Obecně byly užívány zejména při identifikaci genotypů - fingerprintingu, kde rozlišení pomocí zásobních proteinů bylo neúspěšné. Z hlediska plodinového sortimentu nalézají tyto markery vyššího uplatnění u ječmene, brambor, řepky.

Markery využívající polymorfismus nukleových kyselin

Pokrok v oblasti biochemie a molekulární biologie umožnil aplikace dalšího typu biochemicko-genetických markerů - markery založené na polymorfismu DNA. Společným znakem DNA markerů je přímá schopnost detekce alelických variant v sekvenci nukleotidů.

Tanksley (1983) charakterizuje DNA markery následovně:

· jsou aplikovatelné u všech organismů, kde je zvládnutá technika izolace DNA

· nejsou závislé na podmínkách prostředí

· jejich počet je téměř neomezený

· DNA markery lze aplikovat i při minimálním množství biologického materiálu, jsou nedestruktivní

· pomocí DNA markerů lze charakterizovat i velmi raná ontogenetická stádia rostlin.

a) Délkový polymorfismus restrikcních fragmentu - RFLP

RFLP patří mezi historicky starší DNA markery. Metoda využívá délkového polymorfismu restrikčních fragmentů analyzované DNA, který je detekován pomocí hybridizace s homologním fragmentem DNA (sondou). Objev restrikčních enzymů (Smith a Wilcox, 1970) a přenosu elektroforeticky separované DNA z gelu na membránu (Southern, 1975) bylo nutným teoretickým předpokladem pro rozvoj této metody. Ondřej, (1992) uvádí jednotlivé dílčí procesy RFLP:

izolace DNA

restrikční štěpení

elektroforetická separace získaných DNA fragmentů

přenos rozdělených fragmentů z gelu na pevný nosič

hybridizace se značenou sondou

detekce hybridní DNA

Schématické znázornění této metody, která poskytuje kodominantní markery je uvedeno na obrázku 1.

Obrázek 1: Schéma metody RFLP - upraveno podle Ellison (1997)

b) Polymerázová retezová reakce - PCR

Objev termostabilní DNA polymerázy a následná automatizace procesu in vitro amplifikace DNA patentovaná K. B. Mullisem (U.S. patent 4,683,195, July 1987; U.S. patent 4,683,202, July 1987) znamenala rychlý rozvoj PCR markerů, umožňujících rutinní amplifikaci jediné molekuly DNA a detekci jedné kopie genu (Innis a Gelfand, 1990).

Základním principem polymerázové řetězové reakce je amplifikace DNA v in vitro podmínkách. Saiki et al. (1985) použil Klenow fragment z Escherichia coli DNA polymerázyI k amplifikaci DNA. Tyto experimenty jsou považovány za základy PCR. Klenow fragment byl následně nahrazen termostabilními DNA polymerázami. Celý proces byl automatizován a patentován (Mullis, 1987). Diagram jednotlivých kroků PCR je uveden na obrázku 2.

Schéma polymerázové řetězové reakce popisované řadou autorů (Mullis, 1987, Saiki a Gelfand, 1989, Sambrook et al., 1989, Innis a Gelfand, 1990, Samec, 1993) je rozděleno do třech základních kroků:

denaturace templátové DNA

nasedání primerů tzv. annealing

prodlužování nově vznikajícího řetězce DNA.

Jednotlivé kroky nutné pro získání tohoto typu markerů, které mohou být kodominantní i dominantní, jsou uvedeny na obrázku 2.

Produkt amplifikace je obvykle detekován gelovou elektroforézou - obrázek 3. Z obrázku 4 vyplývá, že principem této metody je exponenciální zvýšení počtu kopií detekovaného genu.

Obrázek 2: Schéma metody PCR - upraveno podle Viarstraete (1999)

Obrázek 3: Princip elektroforetické detekce PCR fragmentu - upraveno podle Viarstraete (1999)

Obrázek 4: Exponencionální amplifikace detekovaného genu metodou PCR - upraveno podle Viarstraete (1999)

c) Náhodne amplifikovaná polymorfní DNA - RAPD

Metoda RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) je založena na shodném principu jako PCR. Základní rozdíl je v tom, že výsledkem amplifikace jsou fragmenty DNA, které jsou pro daný genotyp specifické, ale u kterých není možno okamžitě stanovit, zda se jedná o amplifikace určitých genů nebo o amplifikace repetetivních sekvencí. Tyto markery bývají obvykle dominantní a pro vlastní markerování je lez použít až po vyhodnocení hybridologických analýz. Běžně jsou používány pro identifikaci genotypů - fingerprinting.

d) Délkový polymorfismus restrikcne štepené amplifikované DNA - CAPS

Metoda CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) v sobě zahrnuje spojení metod PCR a RFLP. Úvodním krokem je amplifikace PCR markeru. Po následném rozštěpení restrikční endonukleázou jsou detekovány bodové mutace, které umožňují následné elektroforetické odlišení fragmentů markerujícího dominantní a recesivní alelu studovaného genu. Příklad takového tohoto markeru je uveden na obrázku 8.

e) Délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentu - AFLP

Metoda AFLP byla vyvinuta holandskou firmou Keygene v roce 1993 a je také touto firmou patentově chráněna (Vos et al. 1995). Metoda je založena na selekci restrikčních fragmentů genomové DNA pomocí PCR amplifikace (Keygene, 1994). Metoda poskytuje velké množství polymorfních markerů vykazujících kodominanci. AFLP využívající jeden pár primerů (GibcoBrl, 1996) je tvořena následujícími kroky:

restrikční štěpení genomové DNA dvěma restriktázami

navázání specifických adapterů pro tyto restrikční enzymy na fragmenty DNA

preselektivní amplifikace - PCR

selektivní amplifikace - PCR

detekce polymorfismů gelovou nebo kapilární elektroforézou, fluorescenčně, radiografií

Schéma metody AFLP je znázorněno na obrázku 5.

Obrázek 5: Schématické znázornění metody AFLP - upraveno podle Gitzendanner (2000)

e) Variabilita minisatelitní a mikrosatelitní DNA

Tento typ markerů je založen na takzvané abundantní variabilitě genomové DNA. Při markerování nejsou detekovány konkrétní strukturní geny, ale opakující se motivy, které vykazují těsnou vazbu s konkrétními geny. Motivy 10 - 30 nukleotidů, které se opakují 1000 - 100000x jsou označovány jako minisatelity (Jeffreyes et al., 1985). Pro detekci minisatelitů při fingerprintingu je obvykle využívána digesce genomové DNA a hybridizace se značenou sondou.

Tandemové repetice 1 - 5-ti nukleotidů v počtu opakování 10 - 60x jsou označovány jako mikrosatelity neboli SSR (Single Sequences Repeates) (Litt a Luty, 1989, Wu et al., 1994). Powel et al. (1996) charakterizuje mikrosatelitní markery následovně:

· vykazují vysoký stupeň polymorfismu

· jsou relativně rovnoměrně zastoupené po celém genomu

· jsou kodominantní

· jsou založené na PCR

· vyžadují minimální množství analyzované DNA.

f) Sekvencování DNA

Sekvenační techniky jsou složité postupy, jejichž cílem je stanovení sekvence - tj. pořadí nukleotidů ve fragmentech DNA nebo v celých genomech. Přímé sekvence jsou jako markery obtížně využitelné, ale informace o sekvencích genů nebo fragmentů DNA jsou nezbytné pro navrhování primerů pro specifické PCR nebo pro detekci CAPS nebo SSR markerů.

Použití markeru v procesu tvorby nových odrud zemedelských plodin

Možnost využívání genetických markerů v procesu tvorby nových odrůd je obecně označována jako MAS (Marker Assisted Selection). Na využití markerů při selekci poukazuje mimo jiné Gale a Witcombe (1992). Tuto aplikační oblast genetických markerů je možno shrnout do následujících bodů:

· výběr rodičovských genotypů s požadovanými geny

· selekce v hybridních generací na základě markerů

· stanovení homogenity inbredních linií v heterózním šlechtění

· odhad genetické vzdálenosti inbredních linií a odhad heterózního efektu

· detekce translokovaných částí chromozómů - obrázek 6

· detekce transgenů v geneticky modifikovaných organismech.

Výhoda takovéto selekce spočívá zejména v tom, že je detekován konkrétní gen a tím je vyloučen modifikační vliv prostředí. Významný je rovněž i fakt, že nedestruktivní aplikace genetických markerů na juvenilní rostliny může výrazně urychlit a usnadnit selekci v počátečních fázích šlechtitelského procesu. Využití MAS v rezistentním šlechtění zásadně omezuje práci se škůdci a patogeny, které jsou nutné k vytvoření umělého selekčního tlaku. Na obrázku 7 je uveden příklad využití RAPD markeru pro detekci lokusu mlo - genu rezistence ječmene vůči padlí travnímu. Na obrázku 8 je uveden kodominantní CAPS marker pro detekci genu rezistence rajčete vůči háďátku zhoubnému. Detekce transgenů v geneticky modifikovaných rostlinách i produktech získaných z těchto rostlin je možná pouze s aplikací genetických markerů založených na polymorfismu DNA.

Obecně je možné shrnout, že snazší a rychlejší je aplikace MAS u znaků jednoduše založených (monegenně nebo oligogenně řízených). Rovněž aplikace markerů u samosprašných druhů má výhody spočívající v práci s homozygotními genotypy. V současné době je aplikační oblast genetických markerů úspěšně rozšířena i na znaky kvantitativní - QTL (Quantitative Trait Loci). Princip markerování QTL je založen na statistickém vyhledávání potencionálních markerů majoritních genů polygenního systému.

Obrázek 6: PCR marker (Van Campenhout et al., 1995) pro absenci žitné translokace 1RS/1BL u souboru dihaploidních linií pšenice (Triticum aestivum L.) odvozených z F1 generace hybrida odrůd Florida x Bussard - upraveno dle Vejl (1998)

P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S

Obrázek 7: RAPD marker alely mlo 11 pro rezistenci ječmene (Hordeum vulgare L.) vůči padlí travnímu - primer H3 - upraveno dle Vopršal et al. (2000)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Obrázek 8: Kodominantní CAPS marker pro detekci rezistence rajčete vůči háďátku zhoubnému - upraveno dle Skupinová et al. (2001)

1 2 3 4 5 6 7 8 S 9 10 11 12 13 14 15 16 S

Použití markeru v semenárské kontrole

Pro stanovení základních parametrů osiva - odlišitelnosti odrůd, vyrovnanosti a stability a stupně hybridnosti je možno využít markery - zásobní proteiny, izoenzymy, RFLP, PCR, RAPD, CAPS, AFLP i mini- a mikrosatelitní markery. Z historického pohledu byly pro tento účel využívány nejprve markery vycházející z polymorfismu proteinů. Se vzrůstajícím počtem odrůd a současně s jejich vyšší genetickou příbuzností jsou proteinové markery doplňovány o markery založené na polymorfismu nukleových kyselin. Na obrázku 9 je znázorněn RAPD marker použitý pro stanovení uniformity odrůdy pšenice. Použitelnost markerů v semenářské kontrole je dána zejména těmito faktory:

· citlivost pro odlišení co nejširšího spektra genotypů

· spolehlivost výsledků

· finanční a časová náročnost analýz

· kompatibilita metodických postupů mezi jednotlivými laboratořemi.

Obrázek 9: RAPD marker uniformity pšenice (Triticum aestivum L.) odrůdy Florida - upraveno dle Vejl (1998)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Ve spojitosti s využitím markerů pro stanovení odlišitelnosti, vyrovnanosti a stálosti odrůdy ve výsledné semenářské kontrole je nezbytné zmínit se o legislativních opatřeních, které se k této problematice vztahují. Současná (leden 2001) legislativa České republiky (Zákon č. 408/2000 Sb. ze dne 25, října 2000 O ochraně práv k odrůdám rostlin a o změně zákona č. 92/1996 Sb., O odrůdách, osivu a sadbě pěstovaných rostlin, ve znění pozdějších předpisů, Zákon č. 92/1996 Sb. O odrůdách osivu a sadbě pěstovaných rostlin ve znění novely č. 357/1999 Sb.) uvádí využití genetických markerů pouze jako doplňkovou nepovinnou metodu zkoušení osiva. Tato metoda je ÚKZÚZ využívána pouze u sporných případů nebo na vyžádání objednavatele. Při analýzách je využívána zejména elektroforetická separace proteinů prováděná dle normalizovaných metodik UPOV (The International Union for the Protection of New Varieties of Plant) a ISTA (International Seed Testing Association). Tyto normativy v sobě zahrnují zejména:

· přesný popis metodiky

· rozsahy hodnocených vzorků

· počet opakování analýz

· způsob vyhodnocení a reprodukci výsledků.

Markery založené na polymorfismu DNA nejsou v České republice masově využívány v semenářské kontrole a to zejména z důvodů:

· neexistuje legislativní povinnosti tyto analýzy provádět

· vyšší cenová a pracovní náročnost analýz

· omezený počet laboratoří schopných tyto analýzy provádět sériově.

Pro tyto markery v podstatě neexistují žadné směrodatné metodiky. Jednotlivé laboratoře, které tyto metody vyvíjejí a optimalizují vycházejí ze zahraničních metodických postupů. V rámci velkých zahraničních šlechtitelských a semenářských firem jsou genetické markery využívány zejména pro detailní kontrolu odrůdové pravosti a čistoty. Současně slouží jako určitý způsob reklamy, která zaručuje požadovanou kvalitu množitelského materiálu. Tento způsob kontroly není rovněž legislativně vynucen.

Jiná situace je ale v aktuální oblasti detekce transgenů. Detekce geneticky modifikovaných odrůd a produktů připravených z těchto odrůd je realizována v podstatě pouze s využitím DNA markerů. V rámci Evropské unie existují projekty na optimalizaci detekčních technik transgenů. Česká republika je do zmiňovaných programů rovněž zapojena.

Další oblast semenářství, ve které nalézají genetické markery své uplatnění, je kontrola zdravotního stavu množitelského materiálu. Detekce virů a viroidů v množitelských materiálech vegetativně množených rostlin pomocí ELISA metody je u řady plodin nahrazena citlivějšími a specifičtějšími postupy, které využívají DNA markery. Pomocí DNA markerů je rovněž možné identifikovat kontaminaci osiva jinými mikroorganismy. Na obrázku 10 je znázorněna detekce infekce osiva pšenice houbou Fusarium culmorum.

Obrázek 10: Vliv intenzity napadení obilek pšenice houbou F. culmorum na intenzitu amplifikace 700bp PCR markeru (Less, 1995) - upraveno dle Vejl et al. (2000)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 S

Poznámky: 1 - klasy bez příznaků infekce, 14 - maximální stupeň infekce S - hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Kontrola zdravotního stavu s využitím DNA markerů není rovněž v současnosti v České republice povinnou kontrolu. Přesto jsou však řadou šlechtitelských a množitelských pracovišť tyto přesné a vysoce spolehlivé metody využívány.

Záver

Z předchozích kapitol vyplývá, že aplikace genetických markerů ve šlechtění a semenářství je problematika velice široká a poměrně různorodá a to jak z hlediska výchozích teoretických principů, tak i z hlediska aplikačních oblastí. Přesto se v závěru příspěvku pokusíme o shrnutí celé problematiky do následujících bodů:

· Selekce na základě genetických markerů jsou aktuální trendy moderních šlechtitelských postupů, které umožňují jednoznačnou selekci požadovaných genotypů.

· Tyto markery nejsou ovlivňovány vnějším prostředím a vzhledem ke své nedestruktivitě a značné automatizaci umožňují šlechtiteli spolehlivě selektovat ve všech etapách tvorby nové odrůdy.

· Výrazně mohou zefektivnit celý šlechtitelský proces.

· Jejich uplatnění jako MAS je závislá teoretických i praktických znalostech příslušných pracovních kolektivů, na technickém vybavení laboratoří.

· Nepříznivým faktorem je jejich vyšší finanční náročnost, a to zejména v etapách optimalizací MAS.

· V kontrole odrůdové odlišitelnosti, vyrovnanosti a stálosti a pro posouzení hybridnosti heterózních odrůd jsou tyto markery v České republice používány jako nepovinné doplňkové testy.

· Pro posouzení parametrů množitelských materiálů s využitím genetických markerů je bezpodmínečně nutné dodržet normalizované metodické postupy a to z důvodů zaručení objektivity výsledků.

· Pro detekci transgenů v rostlinách i jejich produktech se v rámci Evropské unie v současnosti optimalizují markery založené na polymorfismu nukleových kyselin. Česká republika se těchto projektů rovněž účastní.

· Aktuální je rovněž uplatnitelnost genetických markerů při kontrole zdravotního stavu množitelských materiálů.

Literatura

Citovaná literatura je k dispozici u autorů příspěvku.

Podekování

Tento příspěvek vznikl na základě zobecnění teoretických a praktických poznatků získaných zejména při řešení projektů : EP9107 (NAZV - MZe ČR), EP9229 (NAZV - MZe ČR), EP9357 (NAZV - MZe ČR), EP7254 (NAZV - MZe ČR), GAČR 522/97/0636, 57/2000 - (MŠMT ČR), FRVŠ 58/2000 FRVŠ - (MŠMT ČR), GA AF ČZU 232/10/32899/0, GA AF ČZU 232/10/24998/0, GA AF ČZU 2090/10/17596/0, GA ČZU 232/10/36600/0, MSM 412100002. Rád bych tímto způsobem poděkoval širokému kolektivu odborníků, kteří na těchto projektech spolupracovali.