APLIKACE RAPD MARKERŮ PRO VYHODNOCENÍ GENOTYPOVÉ UNIFORMITY RAJČETE (LYCOPERSICON ESCULENTUM L.)

Application of RAPD markers for genotype uniformity evaluation in tomato

(Lycopersicon esculentum L.)

S. Skupinová, P. Vejl, J. Vopršal, L. Jirásková, J. Korytová, R. Novotný

Česká zemědělská univerzita v Praze

Abstract

By RAPD method was the uniformity of genus Lycopersicon esculentum L.studied. For this experiment were tested two lines (DA, DI), their F1 hybrid (DA x DI) and three registered cultivars (Domino F1, Start F1, Tornádo F1). The RAPD reaction was optimised. During optimisation were tested 52primers. For experiment were selected three primers, which have shown the biggest polymorfism. The synthetic electrophoreograms were constructed. On the basis of Dice`s coefficient of similarity calculation were the dendrograms constructed. The average value of Dice`s coefficient of similarity of lines (DA, DI) and their F1 hybrid (DA x DI) ranging between 62,89% and 76,17%, of the registered cultivars ranging between 81,70% and 96,20%.

tomato, Lycopersicon esculentum L., RAPD, DNA markers, genotype uniformity

Souhrn

Metodou RAPD byla studována genotypová uniformita u druhu Lycopersicon esculentum L. na modelovém souboru linií (DA, DI), jejich F1 hybrida (DA X DI) a F1 hybridních odrůd (Domino F1, Start F1, Tornádo F1). Pro RAPD reakci byly z celkového počtu 52 testovaných primerů vybrány 3, které vykazovaly vysoký polymorfismus. Byly sestrojeny syntetické elelktroforeogramy a na základě výpočtu Diceho podobnostních koeficientů byly sestaveny podobnostní matice a dendrogramy. Průměrné hodnoty Diceho podobnostního koeficientu u pokusného šlechtitelského materiálu linií DA, DI a F1 hybrida DA x DI se pohybovaly od 62,89% do 76,17% a byly nižší oproti hodnotám odrůd registrovaných ve Státní odrůdové knize, které se pohybovaly od 81,70% do 96,20%.

Úvod

Využívání markerů založených na polymorfismu deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ve šlechtění rostlin lze na počátku nového století považovat za zcela běžný metodický postup.

Mezi metody využívající polymorfismus DNA řadíme také RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - náhodná amplifikace polymorfní DNA), která je založená na PCR (Polymerase Chain Reaction - polymerázová řetězová reakce). Podstatou této metody je polymorfismus in vitro amplifikované DNA (deoxyribonukleové kyseliny), která je produktem termostabilních DNA-polymeráz. Princip amplifikace popisují například Chein et al. (1976), Sambrook et al. (1989) a Williams et al. (1990).

RAPD je metoda poměrně rychlá a v současné době již i cenově dostupnou. Paran et al. (1995) spatřuje výhodu metody RAPD nejen v její rychlosti a jednoduchosti, ale také v práci s neradioaktivním materiálem. Ve standardně vybavené molekulární laboratoři proto nalézá tato metoda široké uplatnění. RAPD markery jsou rutinně využívány pro “fingerprinting” a lze jimi rychle a přesně provádět kontrolu odrůdové čistoty osiva, detekci genotypové homogenity rodičovských komponent hybridních odrůd i samotného F1 hybridního osiva.

RAPD markery pro kontrolu čistoty F1 hybridů byly využity u mnoha botanických druhů. RAPD metodu použili pro “fingerprinting” rajčat například Klein-Lankhorst et al. (1991), Kaemmer et al. (1995). Rom et al. (1995) použil RAPD markery pro kontrolu genotypové čistoty tří F1 hybridů rajčat a jejich rodičovských linií. Pro kontrolu čistoty F1 hybridů využil tyto markery např.Bellamy et al. (1996).

Materiál

Do pokusu byl zařazeny šlechtitelské materiály pro tvorbu hybridních odrůd rajčete a odrůdy rajčete firmy Moravoseed spol. s r. o:

· mateřská linie - DA

· otcovská linie - DI

· F1 hybrid - DA x DI

· Odrůdy Start F1, Domino F1, Tornádo F1.

Metodika

Pro izolaci DNA bylo metodou náhodného výběru vybráno 30 klíčních rostlin od každé testované odrůdy nebo linie. Navážka čerstvé hmoty činila 20ng. Rostliny klíčily ve tmě při teplotě 20°C po dobu 10 dní. Pro izolaci DNA byla použita modifikovaná metoda dle Saghai-Maroof et al. (1984). DNA byla UV spektrometricky kvantifikována a ředěna na koncentraci 100 a 10ng/m l-1.Vysokomolekularita DNA byla testována elektroforeticky (1% agarózový gel, 150V, 90 minut).

Byla optimalizována koncentrace jednotlivých komponent náhodné amplifikace polymorfní DNA. Celkově bylo testováno 52 primerů z nichž byly do pokusu zařazeny primery OPG 04 (5` AGCGTGTCTG 3`, Operon, USA) OPG 07 (5` GAACCTGCGG 3`, Operon, USA) a OF 07 (5` CCGATATCCC 3`, GenSet, Francie). Vybrané primery vykazovaly vysoký počet polymorfních zón dobře oddělitelných od sebe. Všech 30 jedinců od každé odrůdy a linie bylo testováno s primerem OPG 04. Po 12 rostlinách od linie DA, DI a F1 hybrida DA x DI bylo dále testováno primery OPG 07 a OF 07. Na základě optimalizace byly sestaveny koncentrace jednotlivých komponent reakční směsi RAPD pro 25m l reakci (tabulka I.) upraveno dle Grzebelus et al. (1997): Templátová DNA 30ng, dNTP 0,4mM, primer 30ng, Taq polymeráza (rekombinantní), 0,7unit, MgCl2 2,5mM, PCR pufr 10mM Tris-HCl (pH 8,8 při 25°C); 50mM KCl, 0,08% Nonited P40 (sada MBI Fermentas, Litva). Pro RAPD s primery OPG 04 a OPG 07 byl použit teplotní a časový profil dle Myburg et al. (1997). Pro RAPD s primerem OF 07 byl použit teplotní a časový profil dle ROM et al. (1995).

RAPD produkty primerů OPG04 byly separovány na horizontální agarózóvé elektroforéze (1,2% gel, 120V, 120min). Vizualizace probíhala barvením DNA fragmentů během separace barvivem ethidium bromid. Elektroforeogramy byly fotografovány Polaroid kamerou. RAPD produkty primerů OPG 07 a OF 07 byly separovány na vertikální polyakrylamidové elektroforéze (4% gel, 60V, 90min). Vizualizace RAPD produktů byla provedena barvením Ag+ ionty. Byly vytvořeny 2 typy syntetických elektroforeogramů sestavených pouze z polymorfních zón:

syntetické elektroforeogramy pro sledovaných 30 jedinců všech testovaných genotypů u RAPD produktů primeru OPG 04.

syntetické elektroforeogramy pro 12 náhodně vybraných jedinců genotypů DA, DI a DA x DI u RAPD produktů získaných kombinací primerů OPG 07 a OF 07.

Genotypová uniformita byla vyhodnocena na základě výpočtu průměrných hodnot Diceho podobnostních koeficientů a dendrogramů sestavených z podobnostních matic. Pro hodnocení genotypové uniformity byl použit počítačový program GelManager for Windows.

Výsledky

U RAPD produktů s primerem OPG 04 všech testovaných genotypů bylo nalezeno a vyhodnocováno celkem 10 polymorfních zón. Kombinací primerů OPG 07 a OF 07 bylo získáno celkem 22 polymorfních zón. Příklady syntetických elektroforeogramů RAPD produktů sestavených pro výpočet Diceho podobnostního koeficientu udávají obrázky 1, 2.

Obrázek 1: Syntetický elektroforeogram linie DI (primer OPG 04)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 8 19 20 1 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Čísla 1-30 označují pořadí jednotlivých rostlin

Obrázek 2: Syntetický elektroforeogram linie DI (kombinace primerů OPG 07 a OF 7).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Čísla 1-12 označují pořadí jednotlivých rostlin

Vypočítané průměrné hodnoty Diceho podobnostních koeficientů získaných vyhodnocením polymorfních zón RAPD produktů s primerem OPG 04 udává tabulka I.

Tabulka I:

Vypočítané průměrné hodnoty Diceho podobnostních koeficientů získaných vyhodnocením polymorfních zón RAPD produktů kombinací primerů OPG 07 a OF 07 udává tabulka II.

Tabulka II:

Na obrázku 3, 4 jsou uvedeny příklady dendrogramů linie DI pro názornější pohled na uniformitu genotypové struktury ve sledovaném DNA markeru.

Obrázek 3: Dendrogram linie DI (primer OPG 04)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

Obrázek 4: Dendrogram linie DI (kombinace primerů OPG 07 a OF 07)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

Diskuse

Z tabulek I, II a z obrázků 3, 4 vyplývá, že existuje genotypová variabilita mezi sledovanými jedinci jedné linie respektive odrůdy u všech sledovaných DNA markerů. Hodnoty Diceho koeficientu u pokusného šlechtitelského materiálu linií DA, DI a F1 hybrida DA x DI se pohybovaly od 62,89% do 76,17% a jsou nižší oproti hodnotám odrůd registrovaných ve Státní odrůdové knize (Domino F1, Tornádo F1, Start F1), které se pohybovaly od 81,70% do 96,20%. Nižší uniformita u pokusného šlechtitelského materiálu (linie DA, DI, F1 hybrid DA x DI) byla studována z hlediska jednoho primeru i z hlediska kombinace dvou dalších primerů. U pokusu se dvěma primery byly hodnoty Diceho podobnostního koeficientu ještě průměrně o 7,5% nižší.

Genotypovou variabilitu samosprašného druhu rajče lze u šlechtitelských materiálů typu linie vysvětlit jejich nedostatečnou homozygotizací do požadované inbrední generace. Je samozřejmé, že i jejich F1 hybridy budou vykazovat rovněž vyšší variabilitu. Testované odrůdy typu F1 hybrid (Domino F1, Tornádo F1, Start F1) vykazují poměrně vysokou uniformitu, zejména odrůda Start F1, kde byla, ve sledovaném DNA markeru, vypočítaná hodnota Diceho podobnostního koeficientu 96,20%. Hodnota Diceho podobnostního koeficientu u samosprašného hrachu (odrůdy Lantra a Menhir), který tvoří odrůdy typu čistá linie, v náhodném DNA markeru činila dle Skupinové (1999) 100%.

Nalezená variabilita u sledovaných genotypů může souviset především se šlechtitelskými aspekty při tvorbě genotypově uniformních linií, na které ukazuje ve své práci Riggs (1988). Zvýšená genotypová variabilita u F1 hybridů rajčete může být podle Rom et al. (1995) také způsobena nežádoucím samoopylením mateřské rostliny. Je pravděpodobné, že analýzou DNA zjištěná poměrně vysoká heterogenita uvnitř linií DA a DI je důsledkem buď nedokončeného nebo narušeného procesu homozygotizace při jejich šlechtění. Vzhledem k tomu, že se jednalo o pokusný šlechtitelský materiál a zároveň tento materiál nevykazoval požadované fenotypové znaky, stanovené ve šlechtitelském cíli, nebyl tento materiál ve šlechtění dále použit. Variabilitu ve sledovaných DNA markerech u odrůd Domino F1, Tornádo F1, Start F1 lze na základě hodnot Diceho podobnostního koeficientu považovat za nízkou a může být způsobena rovněž výše uvedenými aspekty zjištěnými Rom et al. (1995). Je samozřejmé, že tyto odrůdy ve svých fenotypových projevech genů vykazují vysokou uniformitu a splňují legislativní požadavky na uniformitu odrůdy.

Z pokusu je patrné, že metoda RAPD je vysoce citlivá a může v procesu tvorby nových odrůd, a to nejen u rodu Lycopersicon, přispět k zefektivnění a urychlení šlechtitelského procesu. RAPD profily mohou sloužit nejen pro detekci uniformity F1 hybridů a jejich rodičovských linií jako v tomto případě, ale i pro detekci uniformity somatických hybridů. Touto problematikou se zabýval např. Matsumoto et al. (1997) ve své studii o somatických hybridech mezi F1 (Lycopersiconesculentum x L. peruvianum var. humifusum) a Solanumlycopersicoides.

Pro názornost byly výsledky interpretovány rovněž formou dendrogramů, ze kterých je možno snadno určit variabilitu v rámci jednoho genotypu. Velmi zajímavé bylo využití dendrogramu pro názorné předvedení genetické vzdálenosti mezi různými typy odrůd rajčete ve studii, kterou publikoval Williams et al. (1993). Dendrogramy mohou sloužit i jako základ pro budoucí mapování genomu. Tímto problémem se zabývali Joshi a Nguyen (1993). Využívání dendrogramů pro přiblížení dosažených výsledků považuji za velice vhodné.

Záver

Metoda náhodné amplifikace polymorfní DNA je metodou velice citlivou a ve sledovaném DNA markeru jednoznačně odhaluje genotypovou variabilitu. Pro přesnější detekci uniformity je výhodné používat více polymorfních markerů a sestavovat syntetické elektroforeogramy. Pro celkovou interpretaci výsledků je vhodné sestavovat dendrogramy.

Aplikace RAPD markerů pro vyhodnocení genotypové uniformity rajčete (Lycopersicon esculentum L.). může přispět k efektivnějšímu procesu tvorby nových liniových a zejména hybridních odrůd.

Poděkování

Řešitelský tým děkuje šlechtitelské firmě Moravoseed spol. s r. o. za poskytnutý pokusný materiál a za sponzorování vědecko výzkumné práce v oblasti molekulární genetiky a šlechtění rostlin.

Práce je podporována projektem FRVŠ 57/2000, GA AF ČZU v Praze 232/10/24998/0 a výzkumným záměrem MSM 412100002.

Literatura

BELLAMY, A. - VEDEL, F. - BANNEROT, H.:. Varietal identification in Cichorium intybus L. and determination of genetic purity of F1 hybrid seed samples, based on RAPD markers. Plant Breeding, 115, 1996, 128-132.

GRZEBELUS, D. - SZKLARCZYK, M. - MICHALIK, B.: The use of RAPD markers for genotype identification of carrot lines and F1 hybrids. Journal of applied genetics, 38, 1997, 33-41.

Chein, A. - Edgar, D. B. - Trela, J.M. : Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J. Bacteriol., 127, 1976, 1550.

JOSHI, C. - NGUYEN, T.:Application of the random amplified polymorphic DNA technique for the detection of polymorphism among wild and cultivated tetraploid wheats. Genome, 9, 1993, 602-608.

Kaemmer, D. - Weising, K. - Beyermann, B. - BÖ rner, T. - Epplen, J. T. - Kahl, G.: Oligonucleotide fingerprinting of tomato DNA. Plant Breeding, 114, 1995, 12-17.

Klein-Lankhorst, R. M. - Vermunt, A. - Weide, R. - Liharska, T. - Zabel, P.: Isolation of molecular markers for tomato (L. esculentum) using random amplified polymorphic DNA (RAPD). Theor. Appl. Genet., 81, 1991, 661-667.

MATSUMOTO, A. - IMANISHI, S. - HOSSAIN, M. - ESCALANTE, A. - EGASHIRA, H.: Fertile somatic hybrids between F1 (Lycopersicon esculentum x L. peruvianum var. humifusum) and Solanum lycopersicoides. Breeding Science, 47, 1997, 327-333.

MYBURG, A. A. - BOTHA, A. M. -WINGFIELD, B. D. - WILDING, W. J, M.: Identification and genetic distance analysis of wheat cultivars using RAPD fingerprinting. Cereal research communications, 25, 1997, 4, 875 - 882.

PARAN, I. - HOROWITZ, M. - ZAMIR, D. - WOLF, S.: Random amplified polymorphic DNA markers are useful for purity determination of tomato hybrids. HortScience, 2, 1995, 377.

RIGGS,TJ.: Breeding F1 hybrid varieties of vegetables. Journal of Horticultural Science, 63, 1988, 369-382.

ROM, M. - BAR, M. - ROM, A. - PILOWSKY, M. - GIDONY, D.: Purity control of F1 hybrid tomato cultivars by RAPD markers. Plant Breeding, 114, 1995, 188-190.

SAGHAI-MAROOF,M.A. - SALIMAN,K.M. - JOGENES, R.A. - ALLARD, R.V.: Ribosomal DNA spacer-lenght polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, 8014-8019

SAMBROOK, J. - MANIATIS, T. - FRITSCH, E. F.: Molecular cloning. Alaboratory manual. Second edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.

Skupinová, S.: Možnosti využití RAPD markerů pro vyhodnocení genotypové uniformity odrůd zelenin. Osivo a sadba, sborník referátů, KRV AF ČZU v Praze, 1999, 59-63.

WILLIAMS, C. - CLAIR, D.: Phenetic relationships and levels of variability detected by restriction fragment lenght polymorphism and random amplified polymorphic DNA analysis of cultivated and wild accessions of Lycopersicon esculentum. Genome, 9, 1993, 619-629.

Williams, J. G. - Kubelik, A. R. - Livak, K. J. - Rafalski, J. A. - Tingey, S. V.: DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleid Acid Res., 18, 1990, 6531-6535.