IDENTIFIKACE TRANSGENŮ V ROSTLINÁCH, SEMENECH A ODVOZENÝCH PRODUKTECH

Identification of transgenes in plants, seeds and derived products

Jaroslava Ovesná, Zuzana Drašnarová

Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha - Ruzyně

Abstract

Based on results of science and progress in technologies genetically modified organisms have been developed. GMOs have become a part of our environment and food strings in many parts of the world. Newly developed transgenic plants are accepted in EC countries with certain misgivings. EC member countries require therefore labelling of GMOs and products made from them. Protocols suitable for GMO identification have not been fully validated up to now and EC have not issued its final statement. PCR-based techniques are exploited in most cases. However, chips have been developed along with. Using the chips many different transgenes can be detected in one step reaction. Research projects are supported in Czech Republic to develop and introduce efficient protocols

GMO, identification, PCR, EU. metoda

Souhrn

Díky stále se prohlubujícím znalostem a vývoji technologií byly vyvinuty geneticky modifikované organismy. Stávají se součástí životního prostředí a potravního řetězce v řadě zemí. V zemích EU nejsou nové transgenní odrůdy přijímány bez určitých obav. Proto země EU požadují identifikaci takových odrůd a produktů z nich vyrobených. Metody zatím nejsou plně validovány a EU zatím nevydala svá doporučení. Nejvíce se využívají techniky založené na PCR, avšak pracuje se i na vývoji mikročipů, které umožní detekovat mnoho transgenů současně. V ČR jsou podporovány výzkumné projekty zaměřené na řešení tohoto problému.

Konec 19. století a celé století 20. přineslo řadu nových poznatků mezi nimi např. objev zákonů dědičnosti (Mendel), či procesu indukované mutagenese, které byly po celé minulé století využívány k cílenému zlepšování produkčního potenciálu rostlin. Výběr nejlepších donorů cenných znaků, příprava kříženců a následně výběr nejlepších materiálů umožnily vyšlechtit řadu výkonných odrůd. Zavedení moderních pěstebních technik doplněné o integrovanou ochranu rostlin pomohlo několikanásobně zvýšilo výnos mnoha plodin. Přesto se od dob tzv. zelené revoluce nepodařilo ani pomocí nejúčinnějších ochranných prostředků významně snížit ztráty na výnosech způsobené škůdci nebo plevely a následně při skladování. V 50. letech byla objevena struktura a popsána funkce DNA (Watson, Crieg). V průběhu 70. a 80. let byly vyvinuty technologie, které umožňují připravit rekombinantní DNA, tj. molekulu DNA jejíž jednotlivé části pocházejí z DNA odlišných organizmů. Tyto poznatky umožnily odvodit organismy, které by nemohly vznikat evolucí nebo tradičními šlechtitelskými postupy. Tyto organismy nesou část genetické informace z jiného organismu (jiných organismů), která nebyla přenesena křížením. Označují se ako geneticky modifikované organismy (dále jen GMO) a byly vyvinuty na základě znalostí struktury a funkce genomu a postupů, které umožňují cílený přenos genů do jednotlivých organismů. V současné době se jedná zejména o mikroorganismy, které se většinou udržují v uzavřeném prostoru, dále pak rostliny a živočichy. Příkladem úspěšného uplatnění těchto přístupů je např. vývoj bakterií a kvasinek, které produkují humánní inzulín nebo interferon. Tyto látky zachraňují mnoho životů a zkvalitňují životy pacientů.

Na počátku 80. let byla nalezena možnost, jak pozměňovat účinně genetickou informaci rostlin a do současnosti byla optimalizována řada postupů, které umožňují přinášet DNA do rostlinného genomu

Příprava geneticky modifikovaných rostlin zahrnuje řadu kroků od správného výběru genu a přípravy konstruktu, který je do buňky vpravován, přes charakterizaci a výběr transformovaných linií až po kontrolu jejich zdravotní nezávadnosti. Úspěšnost přípravy geneticky modifikovaných plodin závisí na několika stěžejních faktorech.

Účinnost transformace - souvisí s regenerační schopností daného pletiva in vitro, závisí na výběru vhodného způsobu transformace, na dostupnosti totipotentních (regenerace schopných) buněk pro Agrobacterium nebo DNA dopravovanou do buněk pomocí částicových střel. Nezbytná je i dostatečně účinná selekce potenciálních transformantů.

Analýza parametru, který má být genetickou modifikací pozměněn a příprava konstruktu pro transformaci - vyžaduje znalost požadavku šlechtitelů, potřeb trhu, dostatečně hlubokou znalost biochemických drah, které mají být v buňce pozměněny a prověření možností, jak požadované změny dosáhnout. Rovněž je třeba zvolit vhodné nástroje molekulární genetiky, které umožní žádanou změnu navodit (klonování genů, jejich zařazení za vhodné promotory, atd.). Samozřejmě jsou rostliny transformovány i pro vědecké účely s cílem detailně studovat metabolické procesy, fyziologii rostliny.

Selekce transformantů - exprese genu a její stabilita však závisejí i na okolí místa, kam je gen začleněn. Někdy dochází k utlumení (silencing) činnosti genu, výjimečně i k jeho vystřižení. Proto musí být kontrolována míra exprese a její stabilita v následných generacích. Existuje několik faktorů, které v tomto procesu hrají roli. Selekce nejlepší linie se provádí většinou z desítek či stovek transformovaných rostlin.

Uvolnění GM odrůdy pro otevřené nakládání - geneticky modifikované rostliny se neprodukují pouze pro vědecké účely, ale výsledkem jsou i komerční odrůdy. Před jejich uvedením na trh je třeba zvážit rizika, které by taková rostlina mohla způsobit životnímu prostředí. Hodnocena je samozřejmě i vhodnost pro výživu lidí a zvířat. Teprve po vypracování kvalifikovaného odhadu rizika a jeho prověření příslušnými orgány je možné s GMO nakládat v uzavřeném prostoru nebo volně.

První transformované odrůdy byly představeny již v roce 1989 na americkém kontinentě. V polních testech byly na začátku 90. let vyhodnocovány brambory, řepka či bavlna a na trhu se objevila pod názvem FlaverSaver rajčata. Na evropském kontinentě byly přijaty geneticky modifikované odrůdy s rozpaky, možná i proto, že jejich výhody mohli využít zejména zemědělci, avšak pro spotřebitele nepředstavovaly přímý přínos. Je třeba ale vzít v úvahu i problematiku produkce potravin versus růst lidské populace a eroze životního prostředí. Mezi roky 1966 - 1990 rostla zemědělská produkce rychleji než počet obyvatel Země. V posledním desetiletí se tento poměr nepříznivě pozměnil: roční přírůstek lidské populace se odhaduje na 1.7 % a nárůst zemědělské produkce pouze na 1.2 %. Odhaduje se, že v roce 2025 bude třeba zvýšit výrobu až o 25%, u obilovin až o 50 %. Navíc ubývá zemědělské půdy. Proto bude třeba používat odrůdy s vysokým a stabilním výnosem. Odrůdy, které potřebují nižší vstupy a jsou odolné vůči hmyzím škůdcům, suchu a dalším stresovým faktorům budou vysoce ceněné. Odborníci odhadují, že tuto potřebu mohou zajistit pouze geneticky modifikované plodiny.

V posledních dvou letech se v zemích EU vystupňoval odpor části veřejnosti vůči GM odrůdám a produktům z nich vyrobených. Proto řada evropských států vyžaduje potvrzení o tom, že dovážené merkantily a produkty z nich vyrobené neobsahují GMO, respektive jejich obsah nedosahuje 1 % (Comission regulation (EC) No. 1139/98, 49/2000 a direktiva EEC 79/112/EEC).

V rámci EU i ČR jsou navrhovány, optimalizovány a do praxe zaváděny postupy umožňující detekci transgenů. Techniky pro detekci GMO lze rozdělit do dvou hlavních skupin - detekce proteinů, které jsou v rostlině kódovány vneseným transgenem a identifikace DNA. Vzhledem k tomu, že proteiny při zpracování podléhají konfomačním změnám a dochází k jejich denaturaci, vývoj se spíše ubírá směrem identifikace na úrovni DNA. Takové techniky budou zřejmě uplatňovány i pro identifikaci transgenů v osivu i sadbě, protože transgeny v budoucnu nemusí být nutně v těchto vývojových fázích rostlin exprimovány. Současná stanovení vycházejí z předpokladu, že v dosud povolených transgenních odrůdách (USA, Kanada, Japonsko a EU - jen potenciální spotřebitel, nikoliv výrobce) jsou deklarované geny. Při přípravě transgenních odrůd, které jsou v současném světě na trhu, byly použity některé selekční markéry - obvykle rezistence vůči antibiotikům (např. ke kanamycinu - který je odbouráván enzymem neomycinfosfotrasnferáza - NTPII) nebo herbicidům (např. Basta, toleranci zajišťuje enzym phosphinotricinacetyltransferáza - PAT). Také byly použity shodné úseky DNA jako regulační sekvence - např. promotor 35S z viru CaMV nebo terminátor genu pro nopalinsyntázu (NOS). U odrůd prošlých schvalovacím řízením je také znám transgen, který zajišťuje deklarovanou vlastnost odrůdy a je známa alespoň část jeho sekvence. Proto se v pro identifikaci transgenních materiálů zavádějí postupy, při kterých je nejprve detekována přítomnost sekvencí regulačních oblastí a selekčních markerů, které se v určitých kombinacích vyskytují ve všech schválených odrůdách a pak je možné pokračovat identifikovat specifický transgen. V současné době se jedná o metody založené převážně na PCR, ale vzhledem k tomu, že v blízké době mohou být vyvinuty transgenní rostliny, které nebudou obsahovat selekční markery a budou mít jiné typy regulačních oblastí, je možné, že se přejde k mikročipům a budou použity principy DNA/DNA hybridizace.

Bylo také představeno několik technik, které umožňuji semikvantitativní nebo kvantitativní stanovení zastoupení transgenů. Opět se jedná o techniky na bázi PCR a je třeba je ještě validovat.

EU zatím nevydala metodický pokyn pro identifikaci a kvantifikaci transgenů. Podporuje však výzkumné programy, které by měly v nejbližší době umožnit provádět alespoň základní typy analýz účinnými a spolehlivými metodami a to jak pro komerční účely tak pro kontrolu a dohled.

Podekování

Příspěvek byl připraven na základě informací a výsledků získaných při řešení projektu NAZV QC0056.

Literatura

Hardegger, M; Brodmann, P.; Herrmann, A.(1999): Quantitative detection of the 35S promotor and the NOS terminator using quantitative competitive PCR. Eur. Food Res. Technol., 209: 83-87.

Kőppel, E.; Stadler, M.; Lűthy, J.; Hűbner, P.(1997): Sensitive method for the detection of genetically engineered soy bean Roundup Ready. Mitt. Gebiete Lebensm.Hyg., 88:164-175.

Vaitilingom, M.; Pijnenburg, H.; Gendre, F.; Bringnon, P. (1999): Real-Time quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer Maize and Roundup Ready soybean in some representative Foods. J. Agric. Food Chem., 47: 5261-5266.

Vollenhofer, S.; Burg, K.; Schmidt, J.; Kroath, H.(1999): Genetically modified organisms in food-screening and specific detection by polymerase chain reaction. J. Agric. Food Chem., 47: 5038-5043.

Wurz, A.; Bluth, A.; Zeltz, P.; Pfeifer, C.; Willmund, R. (1999): Quantitative analysis of genetically modified organisms (GMO) in processed food by PCR-based methods. Food Control, 10: 385-389.

Zimmermann, A.; Lűthy, J.; Pauli, U. (1998): Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleid acids on soya bean food samples. Z.Lebensm.Unter. Forsch. A, 207: 81-90.

Príloha1:

Schematický postup pri overování prítomnosti transgenu

Izolace DNA: DNA může být izolována z rostlinného materiálu nebo rostlinných produktů. DNA je v produktech již poškozená, rozlámaná, vlivem výrobních procesů. Přesto je možné izolovat úseky dostatečně dlouhé pro identifikaci transgenů

Každá rostlina obsahuje tisíce vlastních genů. Některé z nich jsou pro daný druh specifické.Takové sekvence se používají pro kontrolu čistoty analyzovaného vzorku. Např. u sóji se používá gen pro lectin (protein specifický pro soju) nebo u kukuřice gen jednoho ze zásobních proteinů. V případě, že DNA neobsahuje příměsi inhibitorů reakce, lze metodou PCR amplifikovat vlastní gen rostliny. Pak je možné analyzovat takový vzorek a zjišťovat metodou PCR přítomnost transgenu.

Předpokládá se, že u všech povolených a pěstovaných odrůd transgenních plodin byl v nějaké formě použit pro transformaci úsek z viru mozaiky květáku (35S promotor) Proto se sonda detekující tento úsek používá jako univerzální systém pro detekci transgenů v produktech.

Mimo analyzovaných vzorků se v pro kontrolu amplifikuje DNA izolované ze standardů s odlišným obsahem známého transgenu.

Po stanovení genu pro CaMV promotor, lze analýzu potvrdit stanovením NOS terminátoru, který se rovněž vyskytuje ve většině transgenních odrůd. Lze detekovat i přítomnost specifického transgenu - v soji se nejčastěji vyskytuje gen, který zajišťuje odolnost vůči herbicidu známého pod jménem Roundup (Roundup Ready soja) a v kukuřici odolnost vůči hmyzím škůdcům (gen z Bacillus thuringiensis - tzv. Bt-kukuřice) nebo odolnost vůči výše herbicidu Roundup.

V případě, že je potvrzena přítomnost transgenu ve vzorku, je možné provést kvantitativní stanovení. Jednou z možností je využít tzv. Real -Time PCR. Studovaný gen je amplifikován pomocí běžného primerového páru. Součástí systému je dále - TaqMan sonda (komplementární k části ampliconu), která je na obou koncích značená fluorescenčními barvami. Na 3´ konci je označena tzv. qeuncherem (zhášečem), na 5´ reportérem. Pokud neprobíhá amplifikace, quencher pohlcuje energii reportéru, během amplifikace polymeráza, která má i exonukleázovou aktivitu sondu rozštěpí a reportér se dostane z dosahu quencheru. Dojde k vyzáření detekovatelného signálu. Odečítá se flurescenční signál uvolněných repotérových molekul. v lineární fázi exponenciální křivky vyjadřující nárůst produktu reakce po jednotlivých cyklech.

Je možné využít buď metody kalibrační křivky nebo vnitřního standardu. V druhém případě je možné detekovat v jednom vzorku vlastní gen a transgen současně (dvě odlišně označené sondy) a počítá se poměr počtu kopií “vlastního genu” a transgenu z kalibrační křivky.