DETEKCE FUSARIUM CULMORUM V INFIKOVANÝCH KLASECH A OBILKÁCH PŠENICE POMOCÍ SPECIFICKÉ PCR

Specific PCR detection of Fusarium culmorum in infected wheat ears and corns

Vejl, P. - Skupinová, S. - Vopršal, J.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Souhrn, klíčová slova

Pro detekci F. culmorum v klasech a obilkách ozimé pšenice odrůdy Hana byla použita specifická PCR amplifikace využívající primery, které navrhl Less (1995). U morfologicky typických infekcí byla pomocí specifické PCR vyloučena infekce ostatními houbovými chorobami (rod Tapesia, ostatní druhy rodu Fusarium, rod Microdochium). Bylo zjištěno, že intenzita amplifikace koreluje se stupněm napadení pšenice F. culmorum. Byl navržen metodický postup pro využití PCR při kontrole napadení osiva pšenice F. culmorum.

Klíčová slova: Fusarium culmorum, pšenice, detekce chorob, DNA, Polymerázová řetězová reakce

Summary, keywords

For F. culmorum detection in wheat ears and corns (cultivar Hana) was used specifical PCR with primers designed by Lees (1995). In plants with morfologic typical infection was excepted other fungal diseases (genus Tapesia, other species of genus Fusarium, genus Microdochium) by means specific PCR methods. Correlation between amplification intensity and F. culmorum infection degree was found. Methodical approach for PCR using for infection monitoring of F. culmorum in wheat was designed.

Keywords: Fusarium culmorum, wheat, diseases detection, DNA, Polymerase Chain Reaction

Úvod

Současný trend jednoznačné a vysoce spolehlivé identifikace řady rostlinných patogenů je založen na využití specifických DNA markerů. Tento příspěvek je ukázkou možnosti využití specificky amplifikovaných fragmentů DNA pro detekci F. culmorum v klasech a obilkách ozimé pšenice.

Literární přehled

Rod Fusarium ssp. je původcem významných chorob řady obilovin. Tyto patogeny napadají paty stébel a vytvářejí obdobné symptomy jako původce stéblolamu - Tapesia yallundae a T. acuformis. Tytéž druhy Fusarium ssp. jsou považovány za závažné původce chorob klíčních rostlin a klasů. Fusarium culmorum je typickým představitelem hub, které způsobují zejména u pšenice choroby stébel i klasů (Čača et al., 1981).

Prvotním příznakem infekce F. culmorum jsou zahnědlé plochy a čárkovité pásky na stéblech, které přecházejí do zdravého pletiva a způsobují postupné trouchnivění báze stébla a horní partie kořenů. Za vlhkého počasí je povrch stébel pokryt růžovým myceliem. Tento patogen může rovněž napadat klasy, kdy dochází k odumírání jednotlivých klásků nebo části klasů (Parry a Nicholson, 1996). Houba napadá pšenice během celé vegetace. Výraznější infekce je za teplého a suchého počasí, kdy napadené rostliny výrazně zkracují svůj klas. Napadení F. culmorum způsobuje výrazné snížení výnosu zrna (Čača et al. 1981, Parry a Nicholson, 1996).

Patogenní houby rodu Fusarium se udržují v půdě a mají výraznou konkurenční schopnost vůči ostatním mikroorganismům. Moření osiva je důležitým fytosanitárním opatřením. Zamezuje dalšímu šíření těchto hub, ale přímé odstranění infekce z půdy neumožňuje. Dalšími způsoby omezení výskytu těchto patogenů jsou profylaktické osevní postupy a půdně-hygienická opatření (Warren a Kommedahl, 1973, Čača et al., 1981, Wiese, 1987, Parry et al., 1995, Parry a Nicholson, 1996, Kazda et al. 1997).

Standardní identifikační testy využívající specifické senzitivity patogenních hub k fungicidním prostředkům v kultivačním médiu a morfologické mikroskopické testy jsou v současnosti nahrazovány vysoce citlivými technikami genetických markerů (Vejl a Skupinová, 2000). Mezi standardně používané techniky pro identifikaci patogenů patří postupy vycházející z amplifikace DNA - polymerázové řetězové reakce využívající dvou (PCR) nebo jednoho primeru (RAPD). Tyto postupy vycházejí z objevu termostabilní DNA polymerázy a následné automatizace procesu in vitro amplifikace DNA patentované K. B. Mullisem (U.S. patent 4,683,195, July 1987; U.S. patent 4,683,202, July 1987).

Identifikace chorob pšenice způsobených rody Fusarium, Tapesia a Microdochium pomocí PCR je prováděna v řadě světových molekulárně-diagnostických laboratoří. Identifikaci izolátů těchto chorob pomocí RAPD markerů uvádějí například Vejl et al. (2000). Navrhováním druhově specifických primerů pro rod Fusarium se zabývali například Ouellet a Seifert (1993), Parry a Nicholson (1996) a Doohan et al. (1998). Identifikací F. culmorum v infikovaném osivu pšenice se zabýval Doohan et al. (1998). Výše uvedený kolektiv autorů považuje tento postup detekce F. culmorum ze vysoce citlivou a spolehlivou metodu, která umožňuje postihnout stupeň infekce.

Metody

Biologický materiál

Jako standardy byly použity izoláty Tapesia yallundae, T. acuformis, Fusarium avenaceum, F. culmorum, Microdochium nivale var. majus a M. nivale var. nivale z Výzkumného ústavu zemědělského v Kroměříži. Pro vlastní experimenty byla použita odrůda ozimé pšenice Hana. Zdravé klasy a klasy s různým stupněm vizuálně detekované infekce F. culmorum pocházely z experimentálního pozemku ČZU v Praze.

Klasy byly rozděleny na 14 kategorií dle vizuálně zjištěného stupně napadení. Kategorie ”1” představovala klasy zdravé, kategorie ”14” představovala klasy s maximálním stupněm infekce.

Izolace a purifikace DNA

Pro izolaci DNA ze standardních izolátů i ze zdravých a infikovaných klasů a obilek byly použity modifikované metody, které detailně popisují Doohan et al. (1998) a Vejl et al. (2000). Obě dvě metody využívají extrakční pufr s CTAB (cetyltrimetyl bromid amonný). RNA byla degradována enzymaticky. Kvalita izolované DNA byla ověřena elektroforeticky.

Specifická amplifikace DNA

Pro amplifikaci DNA byla použita metoda specifické PCR o objemu 25m l, která probíhala v termocykleru Cyclogene (Techne, Velká Británie). Pro identifikaci patogenů byly použity následující dvojice primerů, které pro identifikaci použili níže citovaní autoři:

Tapesia yallundae (Nicholson et al., 1997) - (Ty16 5GCG CTG GAA AAA GAG GAC TG3, Ty16R 5TGG AAG GGT CTT GCA GGG3), Tapesia acuformis (Nicholson et al.,1997) - (Ta05F 5GTA TCG GAC GGA GAT CCA GC3, Ta05R 5TTG CTC AGT GCA TTG TCG G3), Fusarium avenaceum (Less, 1995) - (AF 5CAA GCA TTG TCG CCA CTC TC3, AR 5GTT TGG CTC TAC CGG GAC TG3), Fusarium culmorum (Less, 1995) - (FcF 5CAA AAG CTT CCC GAG TGT GTC3, FcR 5GGC GAA GGT TCA AGG ATG AC5), Microdochium nivale var. majus (Nicholson a Parry, 1996) - (Mnm2F 5TGC AAC GTG CCA GAA GCT3, Mnm2R 5AAT CGG CGC TGT CTA CTA AAA GC3), Microdochium nivale var. nivale (Nicholson et al., 1996) - (Y13NF 5acc agc cga ttt gtg gtt atg3, y13nr 5ggt cac gag gca gag tcg3).

Modifikované složení reakce pro identifikaci druhů rodu Tapesia, Fusarium i Microdochium bylo následující: templátová DNA 100,0ng.25m l-1, oba primery 100nM, rekombinantní Taq polymeráza (MBI Fermentas, Litva) 0,7U.25m l-1, dNTP 100m M, MgCl2 1,5mM, Tris-HCl (pH8,8) 10mM, KCl 50mM, Nonidet P40 0,08%. Reakční směs byla převrstvena 30m l minerálního oleje.

Pro amplifikaci DNA rodu Tapesia byl použit následující teplotní a časový profil: 5 cyklů (95,0oC-30s, 66oC-20s, 72 oC-45s), 15 cyklů (95,0oC-30s, 64oC-20s, 72oC-45s), 25 cyklů (95,0oC-30s, 62 oC-20s, 72 oC-45s), 1cyklus (72oC-300s). Pro amplifikaci DNA rodu Fusarium byl použit následující teplotní a časový profil: 40 cyklů (95,0oC-30s, 60oC-30s, 72oC-40s), 1cyklus (72oC-300s). Pro amplifikaci DNA rodu Microdochium byl použit následující teplotní a časový profil: 40 cyklů (95,0oC-30s, 61oC-30s, 72oC-40s), 1cyklus (72oC-300s).

Specifické PCR markery byly separovány na horizontální elektroforéze Sub Cell (Bio Rad, USA) v 1,5% agarózovém gelu při konstantní hodnotě 100V (3,3V na 1cm vzdálenosti mezi elektrodami) po dobu 150 minut. Pro elektroforézu byl použit TBE pufr. Pro vizualizaci bylo použito barvivo ethidium bromid. Pro fotodokumentaci byla použita digitální fotokamera CAMEDIA C-1400L (Olympus, Japonsko).

Výsledky

Neinfikovaný klas odrůdy Hana (kategorie ”1”) je zachycen na obrázku 1. Klas s maximální infekcí (kategorie ”14”) je znázorněn na obrázku 2. Obilky téže odrůdy pocházející z neinfikovaných klasů jsou zachyceny na obrázku 3, maximálně infikované obilky na obrázku 4.

Obrázek 1: Klas pšenice odrůdy Hana bez infekce F. culmorum

Obrázek 2: Klas pšenice odrůdy Hana s maximální infekcí F. culmorum

Obrázek 3: Obilky neinfikovaných klasů Obrázek 4: Obilky klasů s maximální infekcí

Ze všech typů biologického materiálu byla izolována vysokomolekulární DNA s kvalitou vhodnou pro následnou amplifikaci. Pomocí dvojic primerů specifických pro rod Tapesia, ostatní druhy rodu Fusarium a rod Microdochium bylo vyloučeno napadení klasů a obilek těmito taxony.

Na obrázku 5 je znázorněn elektroforeogram, který vyjadřuje závislost intenzity amplifikace 700bp fragmentu typického pro F. culmorum na intenzitě morfologicky zjištěného napadení klasů a obilek.

Obrázek 5: Vliv intenzity napadení F. culmorum na intenzitu amplifikace 700bp specifického fragmentu (Less, 1995)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 S

Poznámky:

1 - klasy bez příznaků infekce, 14 - maximální stupeň infekce

S - hmotnostní standard Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Diskuse

Během experimentů bylo potvrzeno, že optimalizovaná metoda izolace DNA je vhodná pro následnou PCR analýzu. Metoda, kterou detailně popisují Vejl et al. (1999), je vhodná nejen pro izolaci DNA z izolátů patogenů, ale i pro izolaci DNA z infikovaných klasů. Při porovnání s metodou, kterou popisuje Doohan et al. (1998), bylo dosaženo obdobných výsledků.

Pomocí specifických PCR markerů bylo jednoznačně potvrzeno, že modelový soubor klasů je infikován F. culmorum. Pro detekci napadení bylo použito primerů, které navrhl Less (1995). Amplifikovaný fragment měl velikost 700bp. Tuto velikost PCR markeru uvádí též Doohan et al. (1998). Amplifikace DNA pocházející z infikovaných rostlin probíhala s menší intenzitou než amplifikace DNA z čistých izolátů. Tyto rozdíly lze vysvětlit vyšší čistotu templátové DNA pocházející z izolátů F. culmorum. Různou intenzitu amplifikace DNA pocházející z různých částí infikovaných rostlin pšenice uvádí rovněž Doohan et al. (1998).

Prokázaná vysoká citlivost této metody a schopnost postihnout rozsah infekce se plně shoduje s výsledky, které uvádí například Ouellet a Seifert (1993), Parry a Nicholson (1996) a Doohan et al. (1998).

Závěr (praktické doporučení)

V tomto příspěvku jsou prezentovány výsledky optimalizace molekulárně genetické detekce F. culmorum v klasech a obilkách ozimé pšenice v podmínkách Laboratoře genetických analýz ČZU v Praze. Základní metodické kroky, které jsou popsány v kapitole ”Metody”, lze doporučit pro kontrolu zdravotního stavu osiva pšenice s cílem vyloučit nebo potvrdit možnou kontaminaci F. culmorum. Získané výsledky je možno aplikovat rovněž při identifikaci houbových chorob pšenice v různých vývojových fázích rostlin.

Použitá literatura

Čača, Z. - Kollár, V. - Novák, J. B. - Zvára, J.: Zemědělská fytopatologie. SZN, Praha, 1981.

Doohan, F. M. - Parry, D. W. - Jenkinson, P. - Nicholson, P.: The use of species-specific PCR-based assays to analyse Fusarium ear blight of wheat. Plant Pathology, 47, 1998, 197-205.

Kazda, J. - Jindra, Z. - Kabíček, J. - Prokinová, E. - Ryšánek, P.: Choroby a škůdci polních plodin, ovoce a zeleniny. Farmář - Zemědělské listy, Praha, 1997.

LESS, A. K.: Diagnosis and Control of Root Rot Pathogens of Wheat. Buckinghamshire, UK, Open University, PhD thesis, 1995.

Ouellet, T. - Seifert, K. A.: Genetic characterisation of Fusarium strains using RAPD and PCR amplification. Phytopathology, 83, 1993, 1003-1007.

Parry, D. W. - Jenkinson, P. - McLeod, L.: Fusarium ear blight (scab) in small grain cereals - a review. Plant Pathology. 1995, 14, 207-238.

Parry, D. W. - Nicholson, P.: Development of PCR assay to detect Fusarium poae in wheat. Plant Pathology, 45, 1996, 872-883.

VEJL, P. - SKUPINOVÁ, S. - POLIŠENSKÁ, I. - VÁŇOVÁ, M.: Molekulárně genetická studie variability izolátů původců chorob pat stébel pšenice obecné - rodů Tapesia, Fusarium a Rhizoctonia. Zamyšlení nad rostlinnou výrobou - 9. konference, ČZU v Praze, 1999, 212-220.

Vejl,P. - Skupinová, S. - PoliŠenská, I. - Váňová, M.: Distinguishing of isolates of cereal stem disease pathogens of Tapesia genus from isolates of Fusarium and Rhizoctonia genus using RAPD method. Plant Protection Science, 2000, v tisku.

WARREN, H. L. - KOMMEDAHL, T.: Fertilization and wheat refuse effects on Fusarium species associated with wheat roots in Minesota. Phytopathology, 63, 1973, 103-108.

WIESE, M. V.: Compendium of Wheat Diseases. Second edition. APS Press, The American Phytopathological Society, Minnesota, 1987.

Kontaktní adresa

Dr. Ing. Pavel Vejl, Česká zemědělská univerzita v Praze, Agronomická fakulta, Kamýcká 957, 165 21 Praha 6 - Suchdol, telefon: 02-20921645, fax: 02-20921645, e-mail: VEJL@AF.CZU.CZ