MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ STUDIE VARIABILITY IZOLÁTŮ PŮVODCŮ CHOROB PAT STÉBEL PŠENICE OBECNÉ - RODŮ TAPESIA, FUSARIUM A RHIZOCTONIA

Molekulárně genetická studie variability izolátŮ pŮvodcŮ chorob pat stébel pšenice obecné - rodŮ Tapesia, Fusarium a Rhizoctonia

using rapd method to distinguish isolators of cereals stalk disease originators of tapesia genus from isolatorsof fusarium and rhizoctonia genus

P. VEJL*, S. SKUPINOVÁ*, I. POLIŠENSKÁ** a M. VÁŇOVÁ**

* Česká zemědělská univerzita v Praze, agronomická fakulta, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6, Česká republika

** Zemědělský výzkumný ústav Kroměříž s.r.o., Havlíčkova 2787, 767 41 Kroměříž, Česká republika

Souhrn

Metoda RAPD (náhodná amplifikace polymorfní DNA) byla použita pro odlišení izolátů Tapesia acuformis a Tapesia yallundae od izolátů ostatních původců chorob pat stébel pšenice (Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium nivale, Rhizoctonia cerealis a Rhizoctonia solani). Izoláty těchto patogenních hub byly odvozeny z infikovaných rostlin pšenice (Triticum aestivum L.) pocházejících z různých lokalit České republiky. Byly vybrány tři dekamerické oligonukleotidy - primery, které poskytovaly genotypově specifické RAPD produkty. Pro tyto analýzy byla optimalizována metoda izolace DNA z mycélia, podmínky amplifikace a vizualizace elektroforeogramů barvivem SYBR® Gold. Pomocí těchto markerů byly vzájemně odlišeny izoláty všech výše uvedených taxonů. Současně byla u těchto druhů studována vnitrodruhová genetická variabilita. Rozsah variability byl charakterizován hodnotami Diceho podobnostních koeficientů. Grafické vyjádření podobnosti RAPD bylo zpracováno na základě shlukové analýzy. Pro veškeré statistické vyhodnocení byl použit program GelManager for Windows. Z hodnot Diceho podobnostních koeficientů vyplývá, že izoláty druhu Tapesia yallundae vykazovaly vyšší stupeň vnitrodruhové variability oproti izolátům Tapesia acuformis. Vysoký stupeň vnitrodruhové variability byl rovněž nalezen u druhu Fusarium avenaceum.

Tapesia acuformis, Tapesia yallundae, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium nivale, Rhizoctonia cerealis, Rhizoctonia solani, Triticum aestivum L., pšenice obecná, choroby pat stébel, DNA, RAPD

Summary

The RAPD method (Random Amplification of Polymorphous DNA) was used to distinguish Tapesia acuformis and Tapesia yallundae isolators from other originators of wheat stalk base diseases (Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium nivale, Rhizoctonia cerealis and Rhizoctonia solani). Isolators of these pathogenic fungi have been derived from infected wheat plants (Triticum aestivum L.), originating from various localities within the Czech Republic. Three decameric oligonucleotides - primers were selected as genotype-specific RAPD products. For these analyses, a method of DNA isolation from mycelium was optimised, conditions for amplification and visualisation of electrophoreograms were created using a SYBR® Gold dye. By means of these markers were distinguished from each other isolators of all the above-mentioned taxons. Simultaneously, the intra-species genetic variability of these species were studied. The extent of variability was characterised by the values of Dices coefficients of similarity. Graphical representation of RAPD similarity was processed on the basis of cluster analysis. All statistical evaluation was done using GelManager for Windows computer program. The values of Dices coefficients of similarity suggest that isolators of the Tapesia yallundae species showed higher degree of intra-species variability compared to Tapesia acuformis isolators. High degree of intra-species variability was identified also in Fusarium avenaceum species.

Tapesia acuformis, Tapesia yallundae, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium nivale, Rhizoctonia cerealis, Rhizoctonia solani, Triticum aestivum L., DNA, RAPD

Úvod

Pšenice obecná (Triticum aestivum L.) představuje v celosvětovém měřítku jednu z nevýznamnějších obilovin. Produkce této plodiny zajišťuje nejen výživu obyvatelstva, ale je rovněž důležitou součástí krmiv hospodářských zvířat a významnou vstupní surovinou pro řadu odvětví zpracovatelského průmyslu. Efektivita produkce této plodiny je ovlivněna řadou faktorů, mezi významné z nich patří zdravotní stav porostů (Benada et al. 1981).

Tato studie představuje využití genetických markerů založených na polymorfismu DNA pro identifikaci izolátů vybraných významných houbových chorob u rodu Triticum, které postihují kořeny, kořenové krčky, paty stébel a stébla. Cílem experimentů bylo s využitím RAPD markerů jednoznačně odlišit R a W patotypy původce chorob pat stébel pšenice Pseudocercosporella herpotrichoides (respektive Tapesia acuformis a Tapesiayallundae) získaných z infikovaných rostlin v České republice.

Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton je původcem tzv. pravého stéblolamu pšenice. Na napadených rostlinách jsou v oblasti pat stébel patrné eliptické šedohnědé až žlutohnědé skvrny s tmavě ohraničeným přechodem do zdravého pletiva. Tyto symptomy jsou způsobeny vegetativním mycéliem Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton. Během pozdního jara houba vytváří mírně zakřivené konídie (Both a Waller, 1973). V in vitro podmínkách je u této houby možné při kultivaci na bramborovo-dextrátovém agarovém médiu navodit sporulaci (Chang a Tyler, 1964). U houby Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton byly na základě senzitivity k fungicidům identifikovány dva významné patotypy. Patotyp R byl charakterizován nižší citlivostí k triazolovým fungicidům, patotyp W se naopak vyznačoval vyšší citlivostí k tomuto typu fungicidů. Podle současných genetických a taxonomických studií je R patotyp považován za samostatný druh s označením Tapesia acuformis (Dyer et al., 1996) a W patotyp odpovídá druhu Tapesia yallundae (Wallwork, 1987 a Robbertse et al. 1995).

Z hospodářského hlediska představují Tapesia acuformis a Tapesia yallundae jednu z nejnebezpečnějších chorob současného obilnářství, jejíž výskyt je dán zejména vysokým podílem obilovin na orné půdě a chybnou rotací plodin v osevním postupu (Petr, 1983 a Wiese, 1987). Kromě agrotechnických opatření je účinné zkrácení délky stébla pomocí přípravků na bázi CCC [(2-chloroethyl) trimethylamonium chlorid] nebo chemická ochrana s využitím účinných látek typu benomyl, thiophanatemethyl a thiabendazol (Wiese, 1987). V rámci odrůd pšenice (Triticum aestivum L.) neexistují genotypy zcela rezistentní vůči této chorobě. Odlišují se pouze různým stupněm tolerance. Za teoretický genový zdroj rezistence pšenice vůči Tapesia acuformis a Tapesia yallundae je považován rod Aegilops (Wiese, 1987).

Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum a Fusarium nivale jsou považovány za původce fuzáriové hniloby pat stébel. Teplé a suché počasí umožňuje rozvoj zejména F.culmorum a F. avenaceum. Vlhké a chladné období je optimální pro rozvoj F. nivale. Fuzariózy jsou přenášeny zejména osivem (Warren a Kommedahl, 1973, Wiese, 1987).

Dalšími houbami, která způsobují podobné příznaky jako symptomy vyvolané Tapesia acuformis a Tapesia yallundae jsou houby rodu Rhizoctonia. Na kořenech mladých rostlin parazituje druh Rhizoctonia solani (Weller et al. 1986). Druh Rhizoctonia cerealis vytváří na bázi stébla špičaté skvrny hnědé barvy, které se postupně přetvářejí v nekrózy. Při silném napadení dochází k lámaní stébel v oblasti nekróz (Burpee, 1980). Houba přežívá v půdě v podobě sklerócií i několik let (Clarkson a Griffin, 1977, Lipps a Herr, 1982).

Standardní identifikační testy využívající specifické senzitivity patogenních hub k fungicidním prostředkům v kultivačním médiu a morfologické mikroskopické testy jsou v současnosti nahrazovány vysoce citlivými technikami genetických markerů. Tyto markery mohou být založeny na principu izoenzymových spekter (Julian a Lucas, 1990, Moreau a Maraite, 1996) nebo na polymorfismu nukleových kyselin. Analýzy DNA mohou být založeny na principu hybridizace DNA patogena se specifickou značenou sondou (Nicholson et al., 1994). Variabilitu mitochondriální DNA patotypů Pseudocercosporella herpotrichoides studovali s využitím RFLP (délkový polymorfismus restrikčních fragmentů) techniky Nicholson et al. (1993), Takeuchi a Kuninaga (1996).

Mezi další DNA markerovací techniky patří postupy vycházející z amplifikace DNA - polymerázové řetězové reakce využívající dvou (PCR) nebo jednoho primeru (RAPD). Objev termostabilní DNA polymerázy a následná automatizace procesu in vitro amplifikace DNA patentovaná K. B. Mullisem (U.S. patent 4,683,195, July 1987; U.S. patent 4,683,202, July 1987) znamenala rychlý rozvoj PCR markerů, umožňujících rutinní amplifikaci jediné molekuly DNA a detekci jedné kopie genu (Williams et al. 1990, Innis a Gelfand, 1990). Získané fragmenty DNA jsou elektroforeticky separovány na agarózovém nebo polyakryalmidovém gelovém nosiči (Sambrook et al., 1989).

PCR metodu použili pro odlišení Tapesia acuformis od Tapesia yallundae mezi prvními Poupard et al. (1993) a Gac et al. (1996), kteří sledovali variabilitu DNA sekvence pro ribozomální ITS oblast. Pro identifikaci a současně pro kvantifikaci Tapesia acuformis a Tapesia yallundae použil specifické RAPD markery Nicholson et al. (1997). Genetické studie na základě PCR prováděl u rodu Fusarium například Schilling et al. (1996), který odlišil F. graminareum a F. culmorum. Variabilitu u druhu Fusarium poae studoval na základě RAPD polymorfismu Kerényi et al. (1997). Detekci Fusarium avenaceum pomocí polymerázové řetězové reakce uvádí také Turner et al. (1998). Variabilitu rod Rhizoctonia zkoumali pomocí DNA markerů například Nicholson a Parry (1996).

Materiál a STRUČNÁ metodIKA

Izoláty rodů Tapesia, Rhizoctonia a Fusarium byly odvozeny z infikovaných rostlin z různých lokalit České republiky. Izoláty Tapesia yallundae jsou v tomto příspěvku označeny čísly 1-10, izoláty T. acuformis čísly 11-20, izoláty Rhizoctonia solani čísly 21-22, izoláty R. cerealis čísly 23-24, izoláty Fusarium avenaceum čísly 25-34, izoláty F. culmorum čísly 35-37 a F. nivale čísly 38-39. Izoláty byly kultivovány na bramborovo-dextrátovém agarovém médiu podle metody, kterou publikoval Bateman (1993). Pro izolaci DNA bylo použito modifikované metody dle Saghai-Maroof et al. (1984), která využívá pufru s CTAB. RNA byla degradována enzymaticky. Konečná purifikace DNA byla provedena fenol-chloroformovou metodou. Pro amplifikaci DNA byla použita metoda RAPD. RAPD reakce o objemu 25m l probíhala v termocykleru Cyclogene (Techne, Velká Británie). Bylo ověřeno 80 dekamerických primerů firem Genset (Francie), Operon (USA) a BioVendor (ČR). Jedná se o primery: A(5-AGGGCCGTCT-3), B(5-AGCGTCCTCC-3), C(5-GTCAGGGCAA-3).

Složení RAPD bylo následující: templátová DNA 10,0ng.25m l-1, primer 25,0ng.25m l-1, rekombinantní Taq polymeráza (MBI Fermentas, Litva) 0,7U.25m l-1, dNTP 200m M, MgCl2 2,5mM, Tris-HCl (pH8,8) 10mM, KCl 50mM, Nonidet P40 0,08%. Reakční směs byla převrstvena 30m l minerálního oleje. Pro amplifikaci byl použit následují teplotní a časový profil: 1 cyklus (94,0oC-240s), 40 cyklů (94oC-30s, 36,0oC-45s, 72,0oC-90s), 1 cyklus (72,0oC-300s).

RAPD markery byly separovány na horizontální elektroforéze Sub Cell (Bio Rad, USA) v 1,5% agarózovém gelu při konstantní hodnotě 100V (3,3V na 1cm vzdálenosti mezi elektrodami) po dobu 150 minut. Pro elektroforézu byl použit TBE pufr. Pro vizualizaci bylo použito barvivo SYBR® Gold (Molecular Probes, USA). Pro fotodokumentaci byla použita digitální fotokamera CAMEDIA C-1400L (Olympus, Japonsko).

Pro vyhodnocení a statistickou charakteristiku PCR markerů u houbových chorob pat stébel byl použit program GelManager for Windows Version 1.5. (Ó P.J.H. Jackman 1991-1994, BioSystematica, Velká Británie). Pro vyhodnocení byly použity pouze polymorfní RAPD zóny, které byly následně zpracovány jako binární data. Vzájemná podobnost byla charakterizována pomocí vztahu “přítomnost - nepřítomnost” zóny bez ohledu na hodnotu její optické denzity. Vlastní vyhodnocování podobnosti bylo provedeno pomocí Diceho podobnostního koeficientu (Jackman, 1994 ). Podobnostní koeficienty program uspořádal do tzv. matic, které byly vstupními daty pro konstrukci dendrogramů na základě shlukové analýzy UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Averages).

Výsledky

Zvolená metoda izolace poskytovala vysokomolekulární DNA v dostatečném množství a kvalitě vhodné pro následnou amplifikaci. Výtěžnost DNA z 1 kolonie izolátu o přibližném průměru 3cm se pohybovala od 12m g do 20m g. Čistota izolované DNA vyjádřená poměrem absorbancí A260/A280 se pohybovala v intervalu 1,8-1,9. Z celkového počtu osmdesáti testovaných dekamerických primerů poskytovaly pouze tři oligonukleotidy genotypově specifické RAPD zóny, které nebyly zatíženy výskytem nespecifických amplifikací. Sekvence těchto primerů (A, B, C) je uevdena v části “Materiál a stručná metodika”. Na obrázku 1 je uveden příklad elektroforeogramu s vybranými RAPD markery u rodu Tapesia.

Obrázek 1: Elektroforeogram RAPD markerů izolátů rodu Tapesia - primer C, sekvence primeru je uvedena v části “Materiál a stručná metodika”

Tapesia

yallundae acuformis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 S

Poznámka: S - Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Pro statistické zpracování - stanovení Diceho podobnostních koeficientů byly vybrány pouze genotypově specifické zóny - obrázek 2.

Obrázek 2: Přehled detekovaných polymorfních RAPD zón (primery A, B, C)

Tapesia Rhizoctonia Fusarium

yallundae acuformis solani cerealis avenaceum culmorum nivale

Pro izoláty jednotlivých analyzovaných taxonů byly vybrány specifické RAPD markery. Výsledky identifikace - “fingerprintingu” izolátů hub rodu Tapesia, Fusarium a Rhizoctonia je možné shrnout do následujících bodů:

· Rod Tapesia je odlišitelný od všech ostatních taxonů přítomností zóny A7 a současně přítomností zóny C2.

· Izoláty Tapesia yallundae byly od izolátů Tapesia acuformis odlišeny současnou přítomností zón A3, A5, A13, B3, C6, C8, C10 a C13.

· Pro izoláty Tapesia acuformis byly naopak specifické zóny A7, B4, B5, B6, a C17. Tyto zóny se u izolátů Tapesia yallundae nevyskytovaly.

· Pro rod Rhizoctonia byla charakteristická současná přítomnost zón A4, A5 a B5.

· Rhizoctonia solani byla jednoznačně identifikována současnou přítomností zón A12, B7, B8, B10, B15, B18, C10, C11 a C15.

· Rhizoctonia cerealis byla jednoznačně identifikována současnou přítomností zón A8, A11, A13, B13, B16, B19 a C7.

· Rod Fusarium byl odlišen od rodu Tapesia přítomností zóny C11 a současně absencí zóny C7

· Nebyl nalezen společný marker rodu Fusarium, který by umožnil obecně odlišit tento rod od rodu Rhizoctonia.

· Fusarium avenaceum bylo odlišeno od rodu Rhizoctonia současnou přítomností zón B3, B4, B6, C1, C4, C8, C9 a C12.

· Fusarium culmorum bylo odlišeno od rodu Rhizoctonia současnou přítomností zón A7, B12 a C3.

· Fusarium nivale bylo odlišeno od rodu Rhizoctonia současnou přítomností zón A9, A15, C1, C3 a C5.

Z hodnot Diceho podobnostních koeficientů byl stanoven rozsah genetické podobnosti v rámci analyzovaných druhů. Přehledné vyjádření rozsahu genetické variability stanovené metodou RAPD je uvedeno v tabulce 1.

Tabulka 1: Charakteristika Diceho podobnostních koeficientů získaných pomocí RAPD markerů v rámci taxonomické jednotky druh

Hodnoty Diceho podobnostních koeficientů byly použity na sestavení dendrogramu, který je znázorněn na obrázku 3.

Obrázek 3: Genetické vzdálenosti analyzovaných izolátů stanovené shlukovou analýzou komplexně vyhodnocující RAPD markery - primery A, B, C, (sekvence primerů je uvedena v části “Materiál a stručná metodika”)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 [%]

DISKUSE

Metody identifikace izolátů houbových chorob založené na principu polymerázové řetězové reakce jsou využívány řadou autorů. V této práci byla použita metoda RAPD pro odlišení Tapesia acuformis (10 izolátů) a Tapesia yallundae (10 izolátů) od izolátů ostatních původců chorob stébel obilovin - Fusarium avenaceum (10 izolátů), Fusarium culmorum (3 izoláty), Fusarium nivale (2 izoláty), Rhizoctonia cerealis (2 izoláty) a Rhizoctonia solani (2 izoláty). Pomocí této metody byly tyto taxony vzájemně jednoznačně odlišeny.

Izolace DNA

Navržená modifikace CTAB metody izolace genomové DNA (Saghai-Maroof et al., 1984) se ukázala jako vhodná pro získání vysokomolekulární DNA. Testovací elektroforézou bylo potvrzeno, že izolovaná DNA je prosta fragmentů degradovaných molekul DNA a RNA. Podobný způsob izolace DNA u rodu Tapesia využívající extrakčního pufru s CTAB použil mimo jiných rovněž Nicholson et al. (1997). Homogenizaci mycélia v prostředí kapalného dusíku u rodu Tapesia použil například Nicholson et al. (1994). Izoláty rodu Fusarium kultivované na tekutém médiu použil jako výchozí materiál pro izolaci DNA Turner et al. (1998). Enzymatická degradace RNA, která byla v této práci použita není citovanými autory popisována. Žádný z citovaných autorů se také nezmiňuje o výtěžnosti a kvalitě izolované DNA. Hodnoty poměru absorbancí A260/A280 se pohybovaly v intervalu 1,8 - 1,9. Tyto hodnoty odpovídají vysoce čisté DNA. Výtěžnost DNA z jedné kolonie izolátu umožňovala realizaci přibližně 1000 amplifikací.

Amplifikace DNA - RAPD

Druhy Tapesia acuformis a Tapesia yallundae charakterizoval pomocí specifických RAPD markerů Nicholson et al. (1997). Pro výběr vhodných primerů použil rovněž sadu dekamerických oligonukleotidů firmy Operon (USA). Amplifikace DNA popisovaná v této práci probíhala na rozdíl od citovaného autora v reakční směsi o polovičním objemu (25m l). Koncentrace templátové DNA i Taq polymerázy byly obdobné. Koncentrace MgCl2 (2,5mM), která byla použita v námi prováděných RAPD reakcích, byla ve srovnání s Nicholson et al. (1997) vyšší. Zvýšení koncentrace Mg2+ iontů mělo pozitivní vliv na snížení frekvence nespecifických amplifikací a zvýšení podílu RAPD zón s vyšším počtem párů bází. Námi použitá annelační teplota 36oC byla shodná s teplotou, kterou uvádí například Nicholson et al. (1997). Kerényi et al. (1997) blíže nepopisuje chemické složení RAPD reakce. Pro amplifikaci použil také dekamerické oligonukleotidy a vyšší specificitu amplifikací zajistil annelační teplotou 38oC.

Elektroforetická separace markerů a digitalizace elektroforeogramů

Pro separaci RAPD markerů byla použita horizontální elektroforéza s 1,5% agarózovým gelem v TBE pufru. Pro separaci RAPD markerů rodu Tapesia použil Nicholson et al. (1997) rovněž agarózové gely. Podmínky separace a koncentraci gelů však neuvádí. Dělení RAPD markerů rodu Fusarium v agarózovém gelu popisuje rovněž Kerényi et al. (1997). Všichni citovaní autoři použili pro barvení RAPD fragmentů standardní barvivo - ethidium bromid. V této práci bylo pro vizualizaci elektroforeogramů využito vysoce senzitivní barvivo SYBR® Gold (Molecular Probes, USA). Srovnávacími experimenty bylo potvrzeno, že toto barvivo je schopno detekovat RAPD zóny o nízké koncentraci DNA, které ethidium bromidem nelze vizualizovat.

Přímá digitalizace elektroforeogramů kamerou umožnila získání vysoce kvalitních fotodokumentů. Způsob fotodokumentace elektroforeogramů nepopisuje žádný z citovaných autorů

Analýza dat - výpočet Diceho podobnostních koeficientů a konstrukce dendrogramů

Statistické zpracování získaných dat pomocí různých typů podobnostních koeficientů uvádí řada autorů. Například Takeuchi a Kuninaga (1996) použili pro vyjádřeni podobnosti mitochondriálních DNA markerů u rodu Tapesia podobnostní koeficient dle Nei a Li (1979). Stanovení Diceho podobnostních koeficientů pro vyjádření rozsahu genetické variability u rodu Tapesia, Fusarium a Rhizoctonia neuvádí žádný z citovaných autorů. Vstupními daty pro program GelManager for Windows byly binární údaje schematicky znázorněné na obrázku 2. Tento grafický způsob zadávání binárních dat, které detailně popisuje Vejl (1998), umožňuje současné vyhodnocení většího počtu RAPD markerů. Vyjádření genetických vzdáleností pomocí dendrogramů je využíváno řadou autorů. Stejný způsob sestavení dendrogramů využívající výsledky shlukové analýzy (UPGMA), kterým byly vyhodnoceny výsledky uvedené v této publikaci, popisují také Kerényi et al. (1997), Takeuchi a Kuninaga (1996) a Turner et al. (1998).

Vzájemné odlišení izolátů rodu Tapesia, Fusarium a Rhizoctonia

Pro experimenty byly použity izoláty Tapesia acuformis, Tapesia yallundae, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Fusarium nivale, Rhizoctonia cerealis a Rhizoctonia solani, které byly taxonomicky identifikovány standardními kultivačními a morfologickými testy. Tyto metody identifikace popisují například Wallwork (1987), Wiese (1987), Robbertse et al. (1995), Dyer et al. (1996) a Polišenská (1998). Metodou RAPD byla potvrzena genetická odlišnost mezi izoláty, které byly vzájemně odlišeny pomocí výše uvedených testů. Z dendrogramu uvedeného na obrázku 3 jednoznačně vyplývá rozdělení rodu Tapesia na dvě výrazně odlišně větve, které přesně korespondují s taxonomickým zařazením k Tapesia acuformis a k Tapesia yallundae. K podobnému jednoznačnému odlišení obou druhů pomocí PCR markerů dospěl rovněž Nicholson et al. (1997). Variabilitu mezi izoláty pocházejících z různých lokalit u rodu Tapesia nestudoval žádný z citovaných autorů. Z tabulky 1, která statisticky vyhodnocuje získané Diceho podobnostní koeficienty, vyplývá, že analyzované izoláty druhu Tapesia acuformis jsou ve srovnání s druhem Tapesia yallundae méně variabilní. V rámci druhu Tapesia acuformis bylo nalezeno 11 dvojic izolátů se shodným RAPD profilem. Zajímavé jsou rovněž výsledky vyplývající z dendrogramu na obrázku 3 u rodu Fusarium. Izoláty jednotlivých druhů, které jsou standardními metodami obtížněji odlišitelné, byly seskupeny do shluků odpovídajících jejich předpokládanému taxonomickému zařazení. Nejpočetnější z analyzovaných druhů rodu Fusarium - F. avenaceum (10 izolátů) vykazovalo vysokou vnitrodruhovou variabilitu. U tohoto druhu nebyla nalezena ani jedna dvojice izolátů se shodnými RAPD profily. Vysokou variabilitu RAPD zón stanovil v rámci druhu Fusarium avenaceum rovněž Turner et al. 1998. U druh Fusarium culmorum nebyla zjištěna žádná vnitrodruhová variabilita RAPD markerů. V rámci druhů Fusarium nivale, Rhizoctoniacerealis a Rhizoctonia solani nebyly nalezeny shodné dvojice RAPD profilů. Tento výsledek lze vysvětlit malým počtem izolátů výše uvedených taxonů.

V této práci bylo potvrzeno, že techniky PCR představují snadnou a rychlou metodu jednoznačné detekce izolátů hub rodu Tapesia, Fusarium a Rhizoctonia. Vybrané dekamerické oligonukleotidy, které poskytují specifické RAPD markery, budou v následujících experimentech ověřeny, zda jsou schopny detekovat příslušného houbového patogena přímo na napadené části rostliny pšenice (Triticum aestivum L.).

LITERATURA

Citovaná literatura je k dispozici u autorského kolektivu.

Práce byla financována grantem ČZU č. 2060 / 10 /18679 / 0 a výzk. záměrem MSM 412100002.